孟慶森，季燁，張學(xué)成，朱娜娜，武華

（華威特（江蘇）生物制藥有限公司，泰州 225300）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黃病毒科（Flaviviridae ）瘟病毒屬（Pestivirus ）的代表種，在分類上與豬瘟病毒（Classical swine fevervirus，CSFV）和邊界病毒（Border disease virus，BDV）同為一屬，抗原性有交叉性反應(yīng)[1～4]。該病毒可感染牛、羊、豬等多種家畜和野生反芻動(dòng)物，但以牛為主。受感染牛表現(xiàn)為發(fā)熱、白細(xì)胞減少、腹瀉、流產(chǎn)、黏膜糜爛潰瘍等急性感染癥狀及小牛先天持續(xù)性感染[5～7]。1946年Olafson等首次在美國東北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)并分離出BVDV。

李佑民等[8]1980年首次從國外引進(jìn)牛的流產(chǎn)胎兒中分離并鑒定出BVDV，從此證明該病在我國存在。鄭志剛等[9]1980～1990年10年間對(duì)國內(nèi)牛、羊進(jìn)行BVDV血清學(xué)普查，14 581份牛血清中BVDV中和抗體陽性率為19.15%；1993年，王新平等[10]在內(nèi)蒙古地區(qū)對(duì)綿羊的BVDV調(diào)查中，陽性率為14.6%～83.3%，表明綿羊BVDV在我國處于蔓延趨勢(shì)。為了解我國目前BVDV的感染情況，筆者在部分地區(qū)進(jìn)行了BVDV血清學(xué)調(diào)查，為該病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 樣品

在內(nèi)蒙古通遼、林西和吉林九臺(tái)、安徽阜陽、山東聊城、江蘇徐州等地區(qū)分別采集犢牛血液樣品105份、89份、55份、97份、66份、39份，共計(jì)451份。每份血樣采集3～5mL，置于抗凝采血管（肝素或EDTA抗凝劑），2～8℃保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1．2 主要試劑

超純RNA提取試劑盒，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；BVDV陽性血清（批號(hào)∶005-033）、BVDV陰性血清（批號(hào)：20150311）均為實(shí)驗(yàn)室制備。

1．3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 BVDV血清抗體效價(jià)的測(cè)定

用含3.5%馬血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)滅能后待檢樣品、BVDV陽性對(duì)照和陰性對(duì)照血清在96孔U型板內(nèi)進(jìn)行2倍系列稀釋，稀釋度為1∶2、1∶4和1∶8。每個(gè)稀釋度接種2孔，每孔0.1mL。用含3.5%馬血清的DMEM將BVDV中和抗原稀釋為200TCID50/0.1mL。將稀釋好的BVDV中和抗原液按每孔0.1mL加到含有血清的96孔U型板中，置37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中和1h。取培養(yǎng)16～24h、長(zhǎng)成良好的MDBK96孔培養(yǎng)板細(xì)胞，棄去生長(zhǎng)液，將中和1h的病毒與血清的混合物轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板相應(yīng)孔內(nèi)，每孔0.1mL，置于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)并觀察4d，用Spearman-Karber法計(jì)算血清中和抗體效價(jià)。1.3.2 RT-PCR

取待檢樣品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各100μL，按照超純RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增； 95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀系統(tǒng)下檢測(cè)并記錄結(jié)果，計(jì)算BVDV抗原陽性率。

2 結(jié)果與分析

2．1 BVDV血清抗體檢測(cè)結(jié)果

表1 6個(gè)牛群的BVDV血清抗體陽性率

由 表 1 可 知，6 個(gè) 牛 群 的 犢 牛 血 清 中 和 試 驗(yàn)檢測(cè) 的 BVDV 陽 性 率 分 別 為 76.2%、84.3%、91.1%、87.6%、81.8%、25.6%。451份樣品中，陽性血清為354份，總陽性率為78.5%。牛BVDV抗體陽性率所反映的是牛只BVDV過往感染情況、母源抗體獲得情況或疫苗免疫狀況，說明78.5%的牛只已獲得BVDV免疫力。通過BVDV中和試驗(yàn)的方法對(duì)犢牛血清樣品的檢測(cè)確定BVDV抗體陽性率，對(duì)我國牛病毒性腹瀉的防治有一定的參考價(jià)值。

2．2 6個(gè)牛群的BVDV抗原檢測(cè)結(jié)果

表2 6個(gè)牛群的BVDV抗原陽性率及陰性率

由表2可知，6個(gè)牛群的樣品RT-PCR BVDV抗原檢測(cè)的陽性率分別為1.9%、3.4%、0%、5.2%、0%、0%。抗原陽性說明犢?？赡芤迅腥玖伺２《拘愿篂a病毒，或者犢牛本身為持續(xù)感染牛（PI）。

3 討論

本次抽樣檢測(cè)結(jié)果表明，在不同省份采集的451份樣品中，血清的BVDV中和抗體陽性率為25.6%～91.1%，陽性血清為354份，總的陽性率為78.5%。說明BVDV在我國多個(gè)省份普遍存在，同時(shí)各省份BVDV的陽性率存在較大差異；童欽等[11]對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)集約化養(yǎng)牛場(chǎng)病毒性腹瀉的感染情況進(jìn)行研究，烏蘭浩特、巴彥淖爾、呼和浩特3個(gè)地區(qū)的平均陽性率分別為77.80%、48.70%、33.33%，總血清陽性率為58.35%。據(jù)王建領(lǐng)等[12]2012年的調(diào)查，牛病毒性腹瀉流行范圍已經(jīng)遍及我國各地，最高血清抗體陽性率可達(dá)94.1%。近年來，許多血清學(xué)調(diào)查表明，牛病毒性腹瀉在我國多個(gè)省市流行，隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展和奶牛養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；?，牛病毒性腹瀉病毒對(duì)牛場(chǎng)的危害日益嚴(yán)重。當(dāng)前，對(duì)牛病毒性腹瀉進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查顯得尤為重要，可為我國BVDV的防治提供科學(xué)依據(jù)[8]。

我國不同省份的牛病毒性腹瀉病毒抗體水平存在不同的差異，現(xiàn)在不同省份地區(qū)的牛流通量比較大，牛病毒性腹瀉病毒通過牛的運(yùn)輸進(jìn)行傳染的可能性比較大；建議在進(jìn)行牛的運(yùn)輸時(shí)，能夠通過檢測(cè)BVDV抗原，預(yù)防BVDV的擴(kuò)散；我國已經(jīng)研制出了BVDV滅活疫苗（1型，NM01株），牛場(chǎng)可以通過疫苗免疫達(dá)到凈化的目的，降低BVDV陽性血清的陽性率。國外牛疫苗種類較多，對(duì)于牛病預(yù)防體系比較完善，我國需加強(qiáng)疫苗的預(yù)防工作，希望能夠通過不斷的凈化，減少BVDV抗體陽性率。