李晶峰，邊學(xué)峰，牛曉暉，孫佳明，孔慶國，張輝*

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.長春工業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130012；3.吉林省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，吉林 長春 130062

鹿茸為脊索動(dòng)物門哺乳綱鹿科的動(dòng)物梅花鹿CervusNipponTemminck或馬鹿CervuselaphusL.的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，主要用于腎陽不足、精血虧虛，為溫腎壯陽、補(bǔ)督脈、益精血的要藥[2-4]，具有抗腫瘤[5]、強(qiáng)筋骨[6-8]之功效。山藥是薯蕷科多年蔓生草本植物薯蕷DioscoreaoppositaeThunb.干燥根莖，為傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，有健脾養(yǎng)胃、補(bǔ)肺益腎、止瀉利濕等功能[9-10]，有抗氧化[11-13]、抗腫瘤及雌激素樣作用[14]。

藥對又稱對藥，是臨床用藥中相對固定的兩味藥物的配伍形式，是兩味固定中藥配伍在同一方劑中應(yīng)用，起到相輔相成的作用[15-16]。鹿茸-山藥藥對來源于《普濟(jì)方》：將鹿茸(10 g)、山藥(30 g)粉碎置入容器中，加入白酒(500 mL)，密封浸泡7 d以上便可服用，每日飲用15～20 mL。鹿茸-山藥藥對具有補(bǔ)腎壯陽、健脾益精的功效[17]，從古到今應(yīng)用廣泛。鹿茸與山藥單味藥的研究較多，但兩藥合用的研究報(bào)道較少，本文以腎陽虛大鼠為模型，探討鹿茸-山藥藥對的補(bǔ)腎壯陽作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康Wistar大鼠180～220 g，雄性，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號：SCXK-(吉)2017-0004，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物與試劑

鹿茸藥材采自吉林省雙陽市，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為鹿科動(dòng)物梅花鹿CervusnipponTemminck雄鹿未骨化的密生茸毛幼角；山藥購自長春市同仁堂藥店，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖。男寶膠囊(天津力生制藥股份有限公司，批號：1705109)；地塞米松磷酸鈉注射液(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號：1703054)；氫化可的松注射液(河南潤弘制藥股份有限公司，批號：1702211157)；丙酸睪酮(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：17090412)；環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、腎上腺皮質(zhì)酮(CORT)ELISA試劑盒(美國RD公司，批號：20170705A)。

1.3 儀器

Model 680型酶標(biāo)儀(日本TAKARA公司)；HERAEUS HERAcell 150二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；超凈工作臺(tái)(YZ-875蘇州凈化設(shè)備廠)；MULTISKAN FC型酶標(biāo)儀[賽默飛爾(上海)儀器有限公司產(chǎn)品]。

2 方法

2.1 鹿茸-山藥提取物的制備

取鹿茸10 g，山藥30 g(均粉碎過三號篩)，混合均勻，加入400 mL 60%乙醇，超聲提取3次，每次1 h，合并過濾液，濾液在水浴濃縮至干膏(1.04 g)。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

雄性Wistar大鼠90只，隨機(jī)分為9組：空白對照組(0.9%氯化鈉溶液0.01 mL·g-1)；模型對照組[注射氫化可的松2.5 mg·(100g-1)]；中藥陽性藥組(男寶膠囊0.6 g·kg-1)；西藥陽性藥組(丙酸睪酮，10 mg·kg-1，隔天給藥1次)；鹿山高劑量組(1.8 g生藥·kg-1)；鹿山中劑量組(0.9 g生藥·kg-1)；鹿山低劑量組(0.45 g生藥·kg-1)；鹿茸組(0.4 g生藥·kg-1)及山藥組(1.4 g生藥·kg-1)。除空白對照組與模型組外，各組大鼠造模7 d后，按照上述給藥劑量開始給藥，除西藥對照組為隔天給藥1次外，其余各組均每日給藥1次，連續(xù)7 d，給藥同時(shí)不造模[18-20]。末次給藥后稱量各組大鼠體質(zhì)量變化情況。

2.3 大鼠血清中激素水平的測定

末次給藥后，大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈采血，室溫放置30 min后離心收集血清，-80 ℃保存。采用ELISA法檢測血清中cAMP、cGMP、T、FSH、LH、GnRH和CORT水平。

2.4 大鼠性器官臟器系數(shù)的計(jì)算

末次給藥后，大鼠麻醉，處死后迅速剝離前列腺、提肛肌、精液囊，稱濕質(zhì)量，根據(jù)器官系數(shù)=器官濕質(zhì)量/體質(zhì)量，計(jì)算各組大鼠性器官的臟器系數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 鹿茸-山藥藥對對氫化可的松誘導(dǎo)腎陽虛大鼠體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)；鹿山低劑量組大鼠體質(zhì)量顯著增加，與模型比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他各組大鼠體質(zhì)量與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；n=10；下同。圖1 鹿茸-山藥藥對對各組大鼠體質(zhì)量的影響

3.2 鹿茸-山藥藥對對血清cAMP和cGMP水平的影響

與空白對照組比較，模型組cAMP及cAMP/cGMP水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥陽性藥組cAMP與cAMP/cGMP水平顯著提高(P<0.05)，西藥陽性藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，鹿茸、山藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，鹿山高劑量組cAMP與cAMP/cGMP水平顯著提高(P<0.05)，鹿山中、低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見圖2。

注：A.cAMP水平；B.cGMP水平；C.cAMP/cGMP水平。圖2 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠血清中cAMP與cGMP水平的影響

3.3 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠血清中激素水平的影響

3.3.1 對睪酮水平的影響 與空白對照組相比，模型組T水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥陽性藥組T水平顯著升高(P<0.05)，西藥陽性藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，鹿茸組T水平顯著升高(P<0.05)，提示鹿茸具有雄激素樣作用，山藥組、藥對組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見圖3。

圖3 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠血清睪酮水平的影響

3.3.2 對卵泡刺激素水平的影響 與空白對照組相比，模型組FSH水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥陽性藥組、西藥陽性藥組、山藥組FSH水平顯著提高(P<0.05)，鹿山高劑量組FSH水平提高(P<0.05)，鹿山中、低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖4。

圖4 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠血清卵泡刺激素水平的影響

3.3.3 對黃體生成素水平的影響 與空白對照組相比，模型組LH水平降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥陽性藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，西藥陽性藥組LH水平升高，鹿茸組與山藥組LH水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，鹿山高、低劑量組LH水平顯著升高(P<0.05)，鹿山中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見圖5。

圖5 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠血清黃體生成素水平的影響

3.3.4 對促性腺激素釋放激素水平的影響 與空白對照組相比，模型組GnRH水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥、西藥陽性藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，鹿茸組可升高GnRH水平(P<0.05)，提示鹿茸可能作用于下丘腦，促進(jìn)GnRH分泌改善腎陽虛癥狀，山藥組GnRH水平無明顯變化，鹿山藥對組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖6。

圖6 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠血清促性腺激素釋放激素水平的影響

3.3.5 對腎上腺皮質(zhì)酮水平的影響 與空白對照組相比，模型組CORT水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，中藥、西藥陽性藥組CORT水平無明顯改變，鹿茸組CORT水平顯著升高(P<0.05)，提示鹿茸可作用于腎上腺，促進(jìn)CORT分泌，山藥組、鹿山藥對組CORT水平無明顯改變，結(jié)果見圖7。

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；n=10。圖7 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠血清腎上腺皮質(zhì)酮水平的影響

3.4 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠性器官系數(shù)影響

3.4.1 對前列腺系數(shù)的影響 結(jié)果顯示，模型組與空白對照組相比，前列腺系數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，中藥陽性藥組前列腺系數(shù)顯著增加(P<0.05)，西藥陽性藥組、鹿茸及山藥組無明顯變化，鹿山高劑量組顯著增加(P<0.05)，鹿山中、低劑量組并無明顯變化，結(jié)果見圖8。

圖8 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠前列腺系數(shù)的影響

3.4.2 對提肛肌+儲(chǔ)精囊系數(shù)的影響 與空白對照組相比，模型組提肛肌+儲(chǔ)精囊系數(shù)顯著降低(P<0.05)，中藥陽性藥組無明顯變化，西藥陽性藥組提肛肌+儲(chǔ)精囊系數(shù)顯著增加(P<0.05)，鹿茸組、山藥組無明顯變化，鹿山高劑量組提肛肌+儲(chǔ)精囊系數(shù)顯著增加(P<0.05)，提示當(dāng)兩味藥相配伍時(shí)才能發(fā)揮協(xié)同作用增加藥效，鹿山高劑量組效果優(yōu)于西藥陽性藥組，鹿山中、低劑量組無明顯變化，結(jié)果見圖9。

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與西藥陽性藥組比較，△P<0.05；n=10。圖9 鹿茸-山藥藥對對腎陽虛大鼠提肛肌+儲(chǔ)精囊系數(shù)的影響

4 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為“人之根本在于腎，腎主骨生髓”，鹿茸壯腎陽、益精血，山藥有填精固腎、澀精止遺之功效，鹿茸-山藥藥對始載于《普濟(jì)方》鹿茸酒。兩藥合用主治虛弱陽事不舉、面色不明、小便頻數(shù)、飲食不思等腎陽虛證。

本實(shí)驗(yàn)采用氫化可的松致大鼠腎陽虛模型，其成模標(biāo)準(zhǔn)通過檢測血清中cAMP與cGMP含量來篩選[21-23]。氫化可的松干預(yù)后，大鼠細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP及cAMPc/GMP比值降低，基礎(chǔ)代謝下降，同時(shí)抑制下丘腦對GnRH的釋放以及腎上腺對CORT的分泌，使大鼠表現(xiàn)出腎陽虛相關(guān)表型并伴隨相關(guān)指標(biāo)變化[24]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組與空白對照組比較，cAMP及cAMP/cGMP水平均顯著下降，GnRH與CORT顯著降低，與上述腎陽虛模型指標(biāo)相符合，顯示出下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能被抑制[25-26]。LH通過與睪丸間質(zhì)細(xì)胞上的膜受體結(jié)合促進(jìn)睪酮的合成和分泌，F(xiàn)SH通過上調(diào)黃體生成素/人絨毛膜促性腺激素(LH/HCG)受體的表達(dá)加強(qiáng)LH的作用[27]。在本實(shí)驗(yàn)中鹿茸單味藥可通過作用于下丘腦-腎上腺-性腺提高提升GnRH、CORT、T[28]水平來實(shí)現(xiàn)腎陽虛癥狀的改善，而鹿茸-山藥藥對并未顯示對上述3個(gè)指標(biāo)的顯著性變化，可能是由于鹿茸與山藥配伍后，對上述指標(biāo)發(fā)揮藥效的成分發(fā)生改變，需進(jìn)一步研究；鹿茸-山藥是通過增加FSH與LH水平來發(fā)揮促性腺激素樣作用，藥對中主要發(fā)揮提高FSH作用的是山藥，且鹿茸、山藥單味藥均不能使LH水平顯著增加，只有二者合用才能顯著提升LH含量；兩個(gè)單味藥對性器官系數(shù)未顯示出顯著變化，兩味藥配伍后可提高前列腺系數(shù)及提肛肌+儲(chǔ)精囊系數(shù)，具有促進(jìn)雄性器官生長的作用，提示鹿茸-山藥對大鼠有一定的補(bǔ)腎壯陽作用，且是二者共同作用發(fā)揮藥效。中藥陽性藥通過增加腎陽虛大鼠血清中cAMP水平，使激素T、LH水平與前列腺系數(shù)提高，鹿茸-山藥藥對與其相比，同樣可提升cAMP，但升高的激素種類不同(FSH、LH)，并能提升提肛肌+儲(chǔ)精囊系數(shù)；西藥陽性藥通過提高腎陽虛大鼠垂體激素(FSH、LH)水平與提肛肌+儲(chǔ)精囊系數(shù)產(chǎn)生藥效，與西藥陽性藥相比，鹿茸-山藥藥對與其提高激素種類相同，并可提升前列腺系數(shù)。綜上，鹿茸-山藥藥對組通過增加cAMP進(jìn)而影響垂體-性腺軸[29-31]功能，提高垂體激素(FSH、LH)水平與性器官系數(shù)(前列腺系數(shù)及提肛肌+儲(chǔ)精囊系數(shù))來體現(xiàn)對腎陽虛大鼠的治療作用，這是二者配伍產(chǎn)生協(xié)同作用的結(jié)果。

鹿茸和山藥含有多種對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，對機(jī)體功能存在諸多影響，是一種具有廣泛應(yīng)用前途的中藥資源。隨著現(xiàn)代科技水平的提升，我們應(yīng)當(dāng)利用高科技技術(shù)針對中醫(yī)古籍中鹿相關(guān)的經(jīng)方、驗(yàn)方進(jìn)行篩選分析，并在明確市場經(jīng)濟(jì)效益機(jī)制的基礎(chǔ)上，瞄準(zhǔn)鹿茸和山藥功能性食品和藥品，確實(shí)開發(fā)出具有引領(lǐng)效應(yīng)的產(chǎn)品，進(jìn)而通過梅花鹿下游產(chǎn)品開發(fā)帶動(dòng)梅花鹿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，更好地為人類健康服務(wù)。