高云燕，蔡溫姣，歐植澤，馬拖拖，倚 娜，李志遠(yuǎn)

西北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，空間應(yīng)用物理與化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710072

1 引言

萘酰亞胺為平面芳香性雜環(huán)化合物，可通過插入作用或溝槽結(jié)合與雙鏈DNA作用，影響DNA的復(fù)制，阻斷細(xì)胞的分裂過程，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性1。其中米托萘胺(mitonafide)和氨萘非特(amonafide)兩種萘酰亞胺衍生物已進(jìn)入對(duì)實(shí)體腫瘤的藥物臨床III期研究階段2,3。但這些化合物還存在劑量限制性骨髓毒性、神經(jīng)毒性和血液毒性等毒副作用。在萘酰亞胺芳香環(huán)上引入異惡唑烷4、炔基5、嗎啡啉6、多胺7,8等活性基團(tuán)，或者在3位和4位并入各類芳香環(huán)如噻唑雜環(huán)、噻二唑、硫雜環(huán)等9–11，可得到相應(yīng)的衍生物。這些衍生物與雙鏈DNA的結(jié)合常數(shù)可達(dá)105–106L·mol-1，能有效改善萘酰亞胺母體的抗腫瘤活性。傳統(tǒng)的萘酰亞胺藥物以雙鏈DNA為靶點(diǎn)，對(duì)DNA的序列或結(jié)構(gòu)選擇性較差，容易引起毒副作用12,13。針對(duì)特定的核酸序列或者與 DNA作用相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)，是近年來抗腫瘤藥物研究的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)14–17。近年來進(jìn)入臨床試驗(yàn)的萘酰亞胺類藥物UNBS5162和DMP-840可與DNA作用，降低拓?fù)洚悩?gòu)酶活性并發(fā)揮藥效，具有抗癌活性高、毒副作用小的特點(diǎn)，已用于實(shí)體腫瘤和淋巴瘤的治療18。進(jìn)一步研究萘酰亞胺與DNA結(jié)合過程中對(duì)序列選擇性和結(jié)合強(qiáng)度的影響因素，有利于開發(fā)出靶向性更強(qiáng)的藥物19。

在人體端粒末端和原癌基因啟動(dòng)子中存在大量可形成G-四鏈體的富含G-堿基序列20。G-四鏈體的形成會(huì)抑制端粒酶的活性或者相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而 G-四鏈體 DNA解鏈后相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)功能將恢復(fù)21,22。85%以上的惡性腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌、結(jié)腸癌、以及小細(xì)胞肺癌等多種實(shí)體腫瘤中端粒酶表達(dá)呈陽性，而正常體細(xì)胞中通常無端粒酶的表達(dá)。部分以G-四鏈體為靶點(diǎn)的化合物對(duì)癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞的毒性相對(duì)較小，其中Quarfloxin (CX-3543)已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段并取得了良好的療效23,24。因此，設(shè)計(jì)合成能誘導(dǎo)G-四鏈體形成并穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)的化合物，已成為國(guó)內(nèi)外腫瘤靶向治療的新策略25–28。萘酰亞胺衍生物作為一類臨床使用藥物，與G-四鏈體的相互作用也受到了研究者的關(guān)注。單取代萘酰亞胺與G-四鏈體的作用較弱，而多取代萘酰亞胺衍生物與G-四鏈體作用較強(qiáng)，并表現(xiàn)出良好的抗癌活性29,30。三聯(lián)吡啶鉑配合物和硫脲基團(tuán)修飾的萘酰亞胺與G-四鏈體具有很強(qiáng)的相互作用，表現(xiàn)出對(duì)癌細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒性31,32。但是萘酰亞胺衍生物對(duì)G-四鏈體穩(wěn)定性的影響，以及靶向G-四鏈體萘酰亞胺衍生物的結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系尚未得到深入研究33。

含有咪唑及其衍生物的藥物被廣泛用于臨床。近年來的研究表明，多取代咪唑基團(tuán)可作為G-四鏈體穩(wěn)定劑34–36。咪唑陽離子化合物與磷酸根有很強(qiáng)的靜電相互作用，常用于識(shí)別磷酸基團(tuán)37,38。含咪唑陽離子的芘或萘二酰亞胺等芳香化合物對(duì)G-四鏈體有良好親和性和選擇性39,40。本文將咪唑和N-烷基化的咪唑陽離子基團(tuán)引入萘酰亞胺，以增強(qiáng)萘酰亞胺衍生物與G-四鏈體的結(jié)合能力。了解咪唑衍生物結(jié)構(gòu)對(duì)萘酰亞胺與 DNA作用和抗癌活性的影響，利用AutoDock分子對(duì)接方法進(jìn)行計(jì)算機(jī)虛擬篩選，為開發(fā)新型萘酰亞胺類抗癌藥物提供理論據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

碘代正辛烷(分析純)，溴代正辛烷(分析純)，溴代十六烷(分析純)，購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。1-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基甲臢(MTT，分析純)，4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，分析純)，小牛胸腺DNA (CT DNA，分析純)，4-溴-1,8-萘二甲酸酐(分析純)購自 Sigma-Aldrich 公 司 (美 國(guó))。 FHtelo(5′-FAM-GGG-TTAGGG-TTAGGG-TTA-GGG-TAMRA-3′)和 Htelo(5′-GGG-TTA-GGG-TTA-GGG-TTA-GGG-3′)均 由 上海生工合成并純化。其他溶劑和化學(xué)藥品均為分析純，購自北京化工。除非另有說明，光譜滴定實(shí)驗(yàn)都在含有 0.1 mol·L-1K+的 Tris-HCl (10 mmol·L-1，pH 7.4)的緩沖溶液進(jìn)行。所有有機(jī)溶劑均經(jīng)過干燥重蒸后使用。

所用儀器：核磁共振氫譜由BrukerAvance 400核磁共振儀(瑞士，400 MHz)測(cè)定，核磁共振碳譜由BrukerAvance 600 (瑞士)核磁共振儀(碳譜 150 MHz)測(cè)定，熒光數(shù)據(jù)皆在 Hitachi F-4500熒光光譜儀(日本)上測(cè)定，紫外可見吸收光譜用 Hitachi UV-3010紫外可見分光光度計(jì)(日本)測(cè)定，細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)所用儀器為Olympus IX70 (日本)。

2.2 化合物合成

2.2.1 化合物2的合成

4-溴-1,8萘二甲酸酐(1.5 g，5.4 mmol)分散于10 mL乙二醇乙醚中，加入嗎啡啉(0.94 mL，10.8 mmol)，在氮?dú)鈿夥障?30 °C反應(yīng)24 h。除去溶劑后，利用硅膠柱色譜分離(THF/CHCl3的體積比為1/4)，得黃色固體1.33 g，產(chǎn)率86%。1H NMR(CDCl3，400 MHz) δ：8.60–8.58 (d，1H，J = 7.2)，8.54–8.48 (m，2H)，7.78–7.75 (m，1H)，7.29–7.26(m，1H)，4.07–4.05 (m，4H)，3.36–3.33 (m，4H)。

2.2.2 化合物3的合成

化合物2 (0.5 g，1.7 mmol)溶于15 mL吡啶中，逐漸加入 1-(3-氨基丙基)-咪唑(248 g，2.04 mmol)，在氮?dú)鈿夥障?00 °C反應(yīng)24 h得到棕紅色澄清液，除去溶劑后，利用硅膠柱色譜分離(THF/CHCl3的體積比為 1/2)。得黃色固體 0.573 g，產(chǎn)率 83.2%。1H NMR (CDCl3，400 MHz) δ：8.61–8.59 (d，1H，J = 7.2)，8.55–8.53 (d，1H，J =8.0)，8.46–8.44 (d，1H，J = 8.0)，7.75–7.71 (m，1H)，7.59 (s，1H)，7.29–7.24 (m，1H)，7.06–7.03(d，2H，J = 10.4)，4.26–4.29 (m，2H)，4.11–4.03(m，6H)，3.30–3.28 (m，4H)，2.31–2.24 (m，2H)。13CNMR (CDCl3，150 MHz) δ：164.50，164.01，155.96，137.08，132.81，131.41，130.43，129.94，129.18，126.15，125.92，123.02，118.78，116.74，115.03，66.95，53.46，45.10，37.56，29.69。MS(MALDI-TOF)：[M+] 391.1，cacld for C22H22N4O3，390.4。

2.2.3 化合物4a–c的合成

化合物3 (0.3 g，0.76 mmol)分散于15 mL重蒸乙腈中，并轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，攪拌，緩慢滴加鹵代烷(2.28 mmol)，100 °C反應(yīng)24 h。得到黃色澄清液，除去溶劑后采用硅膠柱色譜分離(甲醇/CHCl3的體積比為1/25)，得黃色固體。

4a:產(chǎn)率 63.6%。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ：10.05 (s，1H)，8.54–8.47 (m，2H)，8.41–8.39(d，1H，J = 8.4)，7.78–7.68 (m，2H)，7.52 (s，1H)，7.23–7.21 (d，1H，J = 8.0)，4.50–4.38 (m，4H)，4.21–4.18 (m，2H)，4.03–4.01 (m，4H)，3.18–3.27(m，4H)，2.45–2.41 (m，2H)，2.02–1.88 (m，3H)，1.38–1.26 (m，9H)，0.88–0.84 (m，3H)。13C NMR：(DMSO-d6，150 MHz) δ：163.77，163.24，155.55，136.11，132.22，130.68，130.66，129.22，126.12，125.23，122.61，122.42，122.34，115.84，115.04，66.15，53.02，48.84，46.98，36.46，31.12，29.25，28.44，18.29，25.42，22.02，13.89。MS (MALDITOF)：[M-I]+503.3，cacld for C33H39N4O3，503.6。

4b:產(chǎn)率70%。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ：10.50 (s，1H)，8.55–8.40 (m，3H)，7.77–7.67(m，2H)，7.47 (s，1H)，7.24–7.22 (d，1H，J = 8.0)，4.50–4.39 (m，4H)，4.22–4.19 (m，2H)，4.04–4.02(m，4H)，3.29–3.26 (m，4H)，2.46–2.40 (m，2H)，2.00–1.93 (m，2H)，1.30–1.23 (m，9H)，0.88–0.85(m，3H)。13C NMR (DMSO-d6，150 MHz) δ：163.78，163.25，155.57，136.13，132.22，130.69，130.61，129.27，126.11，125.26，122.63，122.43，122.35，115.85，115.05，66.15，53.03，48.84，46.99，36.47，31.11，29.25，28.43，28.29，25.42，22.01，13.88。MS(MALDI-TOF)：[M-Br]+503.2，cacld for C30H39BrN4O3，503.6。

4c:產(chǎn)率 70%。1H NMR(CDCl3，400 MHz) δ：10.48 (s，1H)，8.55–8.40 (m，3H)，7.76–7.68 (m，2H)，7.45 (s，1H)，7.23–7.21 (d，1H，J = 8.0)，4.51–4.39 (m，4H)，4.22–4.19(m，2H)，4.04–4.02(m，4H)，3.28–3.27 (m，4H)，2.45–2.40 (m，2H)，2.03–1.93(m，3H)，1.24(m，25H)，0.90–0.86(m，3H)。13C NMR (DMSO-d6，150 MHz) δ：(163.75，163.24，155.56，136.16，132.22，130.69，130.66，129.22，126.10，125.25，122.61，122.44，122.38，115.84，115.02，66.15，53.03，48.84，46.97，36.43，31.25，29.24，28.99，29.94，28.87，28.79，28.65，28.34，28.25，25.39，22.05，13.91。MS(MALDITOF)：[M-Br]+615.5，cacld for C38H55N4O3，615.8。

2.3 搖瓶法測(cè)定化合物親脂性系數(shù)(log P)

將 4 mL 化合物 (50 μmol·L-1)的緩沖溶液(Tris-HCl，pH 7.4，10 mmol·L-1)與等體積的正辛醇混合，室溫?cái)嚢?4 h后，在2500 r·min-1條件下離心 9 min，利用紫外-可見吸收光譜測(cè)定化合物在緩沖溶液相濃度Cw和正辛醇相中的濃度Co，采用公式log P = log (Co/Cw)計(jì)算出化合物的親脂性系數(shù)log P，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行三次，取平均值。

2.4 滴定實(shí)驗(yàn)

配制 40 μmol·L-1的萘酰亞胺衍生物的緩沖溶液 1.0 mL (Tris-HCl，pH 7.4，0.1 mol·L-1KCl)，逐漸滴加DNA溶液，并在參比溶液中加入相應(yīng)濃度的 DNA，室溫靜置 15 min后，測(cè)定化合物與DNA混合溶液的紫外-可見吸收光譜。利用公式(1)求得化合物與DNA的結(jié)合常數(shù):

式中 D 為 DNA 的濃度。Δεap= ?εa- εf?，Δε = ?εb-εf?。εa為化合物的表觀摩爾消光系數(shù) εa= Aobs/[化合物]，即用加入不同濃度 DNA后化合物的吸光度值A(chǔ)obs除以化合物濃度得到。εf為未加入DNA時(shí)，化合物的摩爾消光系數(shù)。εb為所有的化合物與DNA結(jié)合后的摩爾消光系數(shù)。Ka為化合物與DNA的結(jié)合常數(shù)。采用D/Δεap與D作圖，利用線性擬合后得到的斜率除以相應(yīng)的截距，進(jìn)而求得Kα。

熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)過程中，先配制化合物(5 μmol·L-1)的緩沖溶液，分別加入不同濃度DNA，室溫靜置15 min進(jìn)行熒光光譜測(cè)試，激發(fā)波長(zhǎng)為402 nm，掃描范圍為425–700 nm。

2.5 CT DNA粘度測(cè)定

將烏氏粘度計(jì)置于 25 °C恒溫水浴槽中，分別測(cè)定Tris-HCl緩沖溶液、DNA溶液和萘酰亞胺衍生物與DNA的混合溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間。CT DNA 的濃度固定為 100 μmol·L-1，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次，取平均值，各次測(cè)量值相差小于0.5 s。按照公式η = (t - t0)/t0計(jì)算相對(duì)粘度，其中t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間，t為不同濃度萘酰亞胺衍生物與 DNA的混合溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間，η0為沒有加入萘酰亞胺衍生物時(shí)DNA溶液的相對(duì)粘度。以(η/η0)1/3對(duì)萘酰亞胺衍生物濃度與DNA濃度的比值作圖，得到DNA的粘度變化曲線。

2.6 圓二色譜(CD)光譜實(shí)驗(yàn)

在緩沖溶液中加入 20 μmol·L-1的 G-四鏈體和 40 μmol·L-1的化合物，4 °C 靜置過夜后，在230–500 nm范圍內(nèi)掃描CD光譜圖。掃描速率100 nm·min-1，帶寬1 nm，讀數(shù)5次，響應(yīng)時(shí)間1 s。

2.7 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)熔溫測(cè)定實(shí)驗(yàn)

配制 Tris-HCl (10 mmol·L-1，pH 7.4)，0.1 mol·L-1Li+，20 mmol·L-1K+的緩沖溶液，加入FHtelo G-四 鏈 體 (0.2 μmol·L-1)， 化 合 物 (1.0 μmol·L-1)，混合均勻后，冰箱靜置過夜。由 27 °C逐漸加熱到 96 °C，升溫速度控制為 1 °C·min-1。以 494 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定 FHtelo在 505–700 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。將G-四鏈體在523 nm處的熒光強(qiáng)度變化值進(jìn)行歸一化后對(duì)溫度作圖，中間拐點(diǎn)處的溫度即為G-四鏈體的熔解溫度。

2.8 分子對(duì)接

為深入了解目標(biāo)化合物與G-四鏈體的結(jié)合模型，采用AutoDock (4.2版本)對(duì)目標(biāo)化合物和G-四鏈體的相互作用進(jìn)行了分子對(duì)接模擬。運(yùn)用Gaussian 09中密度泛函理論方法B3LYP41，選取6-31G(d)基組對(duì)化合物進(jìn)行幾何優(yōu)化，獲得目標(biāo)化合物能量最低的構(gòu)象。人體端粒G-四鏈體的晶體結(jié)構(gòu)模型在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得，其 PDB文件為1KF1，AutoDock過程進(jìn)行了簡(jiǎn)化處理，將 DNA整體結(jié)構(gòu)始終設(shè)定為剛性，而允許對(duì)接化合物有可以轉(zhuǎn)動(dòng)的鍵。使用拉馬克遺傳算法(LGA)對(duì)可能的構(gòu)象和結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行搜索，計(jì)算出最有可能的100種構(gòu)象，從而分析得到化合物與DNA的結(jié)合模式和作用方式。

2.9 細(xì)胞熒光成像

將細(xì)胞與化合物和 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育 4.0 h后，用磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌三次。使用 Olympus IX70熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞成像。DAPI的熒光用405 nm的激光激發(fā)，測(cè)量范圍為425到475 nm；萘酰亞胺衍生物的熒光用488 nm的激光激發(fā)，測(cè)量范圍為500–600 nm。熒光圖像用Olympus FV10-ASW 1.6 viewer software處理。

2.1 0 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT還原法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和 MRC-5細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 1 × 106mL-1，分裝于96孔板中，每孔加入上述細(xì)胞懸液100 μL。第2天分別加入不同濃度的目標(biāo)化合物，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，細(xì)胞培養(yǎng)72 h。棄去培養(yǎng)基后，用磷酸緩沖溶液沖洗兩次，每孔中各加入200 μL 新鮮的培養(yǎng)基和 MTT (5 mg·mL-1) 10 μL，再繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后取出。吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，再將培養(yǎng)板震蕩均勻20 min左右，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光度(OD)，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm，記錄結(jié)果，并按下列公式計(jì)算出被測(cè)物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。根據(jù)公式(2)計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物的合成

G-四鏈體是一種有別于雙鏈 DNA的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)，它由G堿基通過Hoogsteen氫鍵作用形成G-四集體，并進(jìn)一步堆積形成。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在寨卡病毒和艾滋病毒(HIV)的基因末端也存在富含G-堿基的鏈段，并能形成G-四鏈體42,43，因此以G-四鏈體為靶點(diǎn)進(jìn)行篩選和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一。與G-四鏈體作用的化合物大多具有平面芳香大共軛結(jié)構(gòu)且?guī)д姾?，可通過堆積作用和靜電作用等多種結(jié)合模式穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)。將咪唑和咪唑陽離子等基團(tuán)引入萘酰亞胺衍生物，有望提高與G-四鏈體的結(jié)合能力及抗癌活性44,45。本文以 4-溴萘二甲酸酐為原料，通過親核取代反應(yīng)合成4-嗎啡啉萘二甲酸酐，進(jìn)一步與胺丙基咪唑反應(yīng)得到含咪唑基團(tuán)的萘酰亞胺衍生物3 (圖1)。將3與鹵代烷反應(yīng)，得到含有咪唑陽離子的萘酰亞胺衍生物 4a–c，利用1H NMR，13C NMR和質(zhì)譜對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征(圖 S1–S13 (Supporting Information))?；衔?4a和4b均為正辛基取代的咪唑陽離子衍生物，對(duì)離子分別為碘離子和溴離子，其親脂性系數(shù)(log P)分別為 1.43和 0.76?；衔?4c的烷基鏈為十六烷基，其親脂性更強(qiáng)(log P = 1.71，表S1)?；衔?和4a–c的親脂性有利于提高細(xì)胞吸收，增強(qiáng)細(xì)胞毒性46。

圖1 含咪唑基團(tuán)萘酰亞胺衍生物的合成路線Fig.1 Synthetic route for the naphthalimide derivatives containing imidazole moiety.

3.2 紫外-可見吸收光譜滴定

在3的緩沖溶液中加入雙鏈CT DNA后，285和402 nm處的吸收峰強(qiáng)度下降，且402 nm處的減色效應(yīng)大于30% (圖2a)。以402 nm處吸光度的變化值對(duì)DNA濃度作圖，并進(jìn)行線性擬合，求得3 與 CT DNA 的結(jié)合常數(shù)為 1.40 × 104L·mol-1(表1)。加入CT DNA后，化合物4a–c在300–500 nm范圍內(nèi)的吸光度也明顯下降(圖 S14 (Supporting Information))。與雙鏈DNA作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?c ＞ 4b ≈ 4a ＞ 3，說明咪唑正離子的修飾可增強(qiáng)萘酰亞胺衍生物與雙鏈DNA的作用47。

圖2 (a) CT DNA和(b) Htelo G-四鏈體DNA對(duì)3(40 μmol·L-1)吸收光譜的影響Fig.2 UV-Vis titration of 3 (40 μmol·L-1) with (a) CT DNA and (b) Htelo G-quadruplex in Tris-HCl buffer(10 m mol·L-1,pH 7.4) containing 0.1 mol·L-1 KCl.

化合物3與Htelo G-四鏈體的相互作用也可由吸收光譜檢測(cè)。Htelo G-四鏈體的加入可引起3的吸收峰強(qiáng)度下降(圖 2b)，利用線性擬合可求得二者的結(jié)合常數(shù)為 7.8 × 106L·mol-1(表 1)?；衔?a-c和Htelo G-四鏈體DNA也具有很高的親和性(Ka＞ 4 × 106L·mol-1) (圖 S15 (Supporting Information))，與文獻(xiàn)報(bào)道的多取代萘酰亞胺衍生物30，苝二酰亞胺衍生物48，金屬配合物等相當(dāng)49?；衔?和4a-c與Htelo G-四鏈體的結(jié)合常數(shù)是其與雙鏈DNA結(jié)合常數(shù)的30倍以上，說明3和4a-c可作為G-四鏈體的穩(wěn)定劑?；衔?b對(duì)G-四鏈體 DNA的親和力高于 4a，表明陰離子種類也可影響化合物與DNA的作用50。在紫外滴定過程中沒有觀察到等吸收點(diǎn)，表明化合物與CT DNA及G-四鏈體的作用存在多種結(jié)合模式32。

表1 紫外-可見吸收光譜測(cè)定的萘酰亞胺衍生物與雙鏈CT DNA和Htelo G-四鏈體的結(jié)合常數(shù)(Kα,L·mol-1)Table1 Association constant (Kα,L·mol-1) of naphthalimide derivatives with duplex CT DNA and Htelo G-quadruplex DNA determined by UV-Vis spectroscopy.

表2 雙鏈CT DNA和Htelo G-四鏈體DNA對(duì)萘酰亞胺衍生物熒光強(qiáng)度的影響Table2 Effects of double-stranded CT DNA and Htelo G-quadruplex DNA on the fluorescence enhancement(F/F0) of naphthalimide derivatives.

3.3 熒光光譜滴定

4-胺基取代的萘酰亞胺衍生物的熒光對(duì)環(huán)境比較敏感，利用熒光光譜可以了解萘酰亞胺衍生物與DNA作用后所處化學(xué)環(huán)境的變化51。CT DNA的加入可使 3和 4a–c的熒光增強(qiáng)(圖 S16(Supporting Information))。當(dāng)CT DNA與化合物的濃度比為20時(shí)，化合物的熒光可增強(qiáng)至1.48–3.68倍(圖3和表2)。Htelo G-四鏈體DNA的加入可使3和4a–b的熒光強(qiáng)度增加7倍以上，而4c的熒光增強(qiáng) 1.73倍(圖 S17 (Supporting Information))。這表明取代基對(duì)萘酰亞胺衍生物與 DNA的作用有影響52。萘酰亞胺衍生物3和4a-c可作用于G-四鏈體的疏水區(qū)域，減小水分子對(duì)化合物的熒光猝滅，從而使熒光增強(qiáng)，這與化合物在低極性溶劑中熒光較強(qiáng)的性質(zhì)相符合(圖 S18 (Supporting Information))53。

圖3 不同濃度的(a) CT DNA和(b) Htelo G-四鏈體DNA后，萘酰亞胺衍生物的熒光強(qiáng)度變化Fig.3 The fluorescence enhancement (F/F0) of naphthalimide derivatives upon addition of(a) CT DNA and (b) Htelo G-quadruplex.

3.4 DNA的粘度研究

DNA的粘度對(duì)其分子長(zhǎng)度的變化非常敏感，是判斷小分子與DNA結(jié)合方式的重要依據(jù)54。小分子與DNA發(fā)生插入作用會(huì)使DNA相鄰堿基之間的距離增大，雙螺旋伸長(zhǎng)，粘度增加；而發(fā)生靜電作用或溝槽結(jié)合時(shí)，DNA的粘度不會(huì)發(fā)生明顯變化55,56。為進(jìn)一步確定萘酰亞胺衍生物與雙鏈DNA的作用方式，用烏式粘度計(jì)在25 °C測(cè)定了CT DNA在3、4a-c、EB存在下的粘度變化。如圖4所示，CT DNA的相對(duì)粘度隨著萘酰亞胺衍生物濃度的增大而明顯增大，說明萘酰亞胺衍生物與 CT DNA的作用方式為插入作用1?；衔?a-c對(duì) DNA粘度的影響與典型的 DNA插入劑EB相當(dāng)，而3對(duì)DNA粘度的影響小于EB，表明在萘酰亞胺衍生物中引入正電荷有利于插入作用。

圖4 在含有 0.1 mol·L-1 KCl的 Tris-HCl (10 mmol·L-1，pH 7.4)緩沖溶液中不同濃度萘酰亞胺衍生物和EB對(duì)CT DNA (0.1 mmol·L-1)粘度的影響Fig.4 Effect of naphthalimide derivatives and EB on the relative viscosity of CT DNA (0.1 mmol·L-1) in Tris-HCl(10 mmol·L-1，pH 7.4) buffer containing 0.1 mol·L-1 KCl.

圖5 (a)含K+和(b)不含K+的Tris-HCl緩沖液中，加入化合物3，4a-c對(duì)Htelo G-四鏈體CD譜的影響Fig.5 CD spectra of Htelo (20 μmol·L-1) inTris-HCl (10 mmol·L-1,pH 7.4) upon addition of 3,4a-c(40 μmol·L-1) (a) in the presence of 0.1 mol·L-1·K+ and (b) in the absence of K+ .

圖6 化合物3，4a-c對(duì)FHtelo G-四鏈體熔解溫度(Tm)的影響Fig.6 Effect of naphthilimides 3,4a-c on the melting temperature (Tm) of FHtelo G-quadruplex[FHtelo] = 0.2 μmol·L-1;[3] = [4a] = [4b] = [4c] = 1.0 μmol·L-1

3.5 圓二色譜(CD)研究

在K+緩沖溶液中，Htelo G-四鏈體的CD譜在265、295 nm處各有一個(gè)正峰，是一種典型的混合型結(jié)構(gòu)(圖5a)。隨著化合物3和4a–c的加入，CD信號(hào)峰基本不發(fā)生變化，表明Htelo G-四鏈體在這種條件下仍然保持混合型結(jié)構(gòu)25–28。

在不含堿金屬離子的 Tris-HCl緩沖溶液中，Htelo G-四鏈體的CD譜在255，295 nm處各有一個(gè)正吸收峰，表明它以未折疊結(jié)構(gòu)和四鏈體的混合形式存在(圖5b)。加入3和4c后，譜圖沒有明顯變化，表明3和4c不能誘導(dǎo)未折疊的Htelo序列形成四鏈體結(jié)構(gòu)。但是隨著4a和4b的加入，在295 nm處的正峰強(qiáng)度增強(qiáng)，在265 nm左右出現(xiàn)負(fù)峰，但是與典型的反平行結(jié)構(gòu)或平行結(jié)構(gòu)G-四鏈體的 CD譜在峰位上還有差異，其具體構(gòu)型還有待于進(jìn)一步研究57。

3.6 熒光共振能量傳遞(FRET)研究

通過 FRET方法可以研究萘酰亞胺衍生物穩(wěn)定端粒G-四鏈體的能力。如圖6所示，F(xiàn)Htelo本身的熔解溫度為 52.7 °C。加入化合物 3和 4a–c后，F(xiàn)Htelo的熔解溫度分別變?yōu)?8.3、63.2、60.9和 60.3 °C，其ΔTm分別為 5.8、10.7、8.4 和 7.8 °C，表明3、4a–c能夠有效穩(wěn)定FHtelo的四鏈體結(jié)構(gòu).

3.7 分子對(duì)接研究

為進(jìn)一步了解萘酰亞胺與端粒 G-四鏈體DNA的結(jié)合模式，我們進(jìn)行了分子對(duì)接研究58。采用密度泛函(DFT)對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，再與端粒G-四鏈體DNA的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:1KF1)進(jìn)行分子對(duì)接。在AutoDock分子對(duì)接過程中，常忽略 G-四鏈體穩(wěn)定劑中陰離子對(duì) DNA結(jié)合的影響59。因此我們僅研究3、4a和4c的分子對(duì)接。由圖8可以看出，3、4a和4c的萘酰亞胺基團(tuán)均位于TTA環(huán)和G-四分體形成的loop及溝槽區(qū)，存在疏水相互作用60?；衔?3的咪唑基團(tuán)與DG16堿基2位上的氨基形成氫鍵，鍵長(zhǎng)約為2.060 ? (1 ? = 0.1 nm，圖7a，b)。咪唑基與DNA堿基之間的氫鍵可增強(qiáng)藥物與DNA的相互作用61?；衔?a和4c中的季銨鹽N原子與G-四鏈體的磷酸骨架的距離為 3 ?左右，表明存在靜電相互作用(圖7c–f)62。4c中的酰胺羰基與DG14堿基2位上的氨基之間還存在氫鍵作用(圖 7e，f)?；衔?、4a和4c與G-四鏈體間存在疏水作用、靜電相互作用或氫鍵等多種結(jié)合方式，因而與Htelo G-四鏈體間的結(jié)合常數(shù)較高。

圖7 化合物 3 (a，b)，4a(c，d)和 4c (e，f)與端粒 G-四鏈體DNA (PDB ID:1KF1)對(duì)接作用的模式圖。紅色虛線表示化合物與G-四鏈體間的氫鍵或靜電作用Fig.7 Different views of the docked model of 3 (a,b),4a (c,d) and 4c (e,f) with telomeric G-quadruplex DNA(PDB ID:1KF1).The red dashed lines represent the hydrogen bonding or electrostatic interaction betweennaphthalimides and G-quadruplex.

3.8 細(xì)胞熒光成像

4-氨基萘酰亞胺基團(tuán)有很好的熒光特性，因此可以通過熒光成像了解化合物的細(xì)胞分布。將A549細(xì)胞分別用3、4b以及細(xì)胞核定位染料4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)在37 °C孵育4 h后，在細(xì)胞核內(nèi)可以明顯觀察到 DAPI的藍(lán)色熒光，3和4b的黃綠色熒光(圖8)。但是3孵育的細(xì)胞，除了細(xì)胞核內(nèi)有明顯的熒光外，在其他區(qū)域還可觀察到一些分散的弱綠色熒光(圖8a，c)。這說明4b比3能夠更快地進(jìn)入細(xì)胞核?；衔?a和4c的細(xì)胞成像結(jié)果與4b相似，與A549細(xì)胞作用4 h后主要位于細(xì)胞核(圖S19 (Supporting Information))?；衔?a–c帶有正電荷，且具有合適的親疏水性，因而可以快速進(jìn)入細(xì)胞核31,50。這些結(jié)果表明，本文合成的咪唑基團(tuán)修飾萘酰亞胺具有與 DAPI相似的細(xì)胞滲透性并且可用于細(xì)胞核定位。

圖8 A549細(xì)胞用化合物(a) 3，(d) 4b，及DAPI (b，e)孵育4.0 h后的熒光成像。(c) 圖 (a)和(b)的疊加圖；(f) 圖(d)和(e)的疊加圖Fig.8 Fluorescence images of A549 cells incubated with(a) 3,(d) 4b ,and DAPI (b,e) for 4.0 h.(c) merged image of(a) and (b);(f) merged image of (d) and (e).

表3 萘酰亞胺衍生物對(duì)A549和MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞毒性Table3 Data for the cytotoxicity (IC50,μmol·L-1) of naphthalimides against A549 and MRC-5 cells.

3.9 細(xì)胞毒性作用

文獻(xiàn)報(bào)道能夠穩(wěn)定端粒 G-四鏈體 DNA的小分子化合物能夠降低端粒酶的活性，從而抑制癌癥細(xì)胞的無限增殖，因此好的 G-四鏈體穩(wěn)定劑具有潛在的抗癌功效25–28。使用米托萘胺(Mitonafide)作為對(duì)照，通過MTT法測(cè)定3和4a–c對(duì)肺癌細(xì)胞A549的體外細(xì)胞毒性。經(jīng)過72 h的孵育，3和4ac均表現(xiàn)出良好的抗癌活性(表 3和圖 S20(Supporting Information))?；衔?a-c的 IC50值分別為 2.64、2.23 和 3.34 μmol·L-1，與臨床藥物米托萘胺(IC50= 3.78 μmol·L-1)相當(dāng)，但它們對(duì)腫瘤細(xì)胞A549 的抑制作用明顯強(qiáng)于 3 (IC50= 15.3 μmol·L-1)，可能是由于含咪唑正離子的化合物能夠更好的定位于細(xì)胞核(圖8)。作為對(duì)照，我們也測(cè)定了這幾種化合物對(duì)正常人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5的細(xì)胞毒性?；衔?a和4b對(duì)A549細(xì)胞比對(duì)非癌細(xì)胞MRC-5有更強(qiáng)的抑制作用，這表明4a和4b作為抗癌藥物具有良好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了含咪唑基團(tuán)和咪唑陽離子的萘酰亞胺衍生物，所得化合物可通過疏水作用、氫鍵或靜電作用等多種作用方式與人體端粒G-四鏈體 DNA結(jié)合，因而對(duì) G-四鏈體具有較高的親和性和選擇性，并能夠提高其熔解溫度。咪唑修飾萘酰亞胺衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)DNA結(jié)合，細(xì)胞毒性等性能有較大影響?；衔?a和4b可快速進(jìn)入癌細(xì)胞A549的細(xì)胞核，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞毒性。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在酰胺位置上引入咪唑基團(tuán)是增強(qiáng)萘酰亞胺衍生物與G-四鏈體等特定核酸序列結(jié)合能力的一個(gè)有效途徑，并有望獲得抗癌活性高、毒副作用小的藥物。

Supporting Information: available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.