趙海燕， 楊東， 洪偉， 邵花平

南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)宿遷市人民醫(yī)院(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院)感染科(江蘇宿遷 223800)

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，全球約20億人曾感染HBV[1]，我國(guó)現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9 300萬人[2]。HBV感染可導(dǎo)致病毒性肝炎，易慢性化并逐漸發(fā)展為肝硬化甚至肝衰竭、肝癌。目前研究表明慢性乙型肝炎細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)是由宿主免疫反應(yīng)和病毒共同作用的結(jié)果，外周血淋巴細(xì)胞亞型數(shù)量及功能的改變可以反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。乙型肝炎病毒標(biāo)志物(HBV-M)是監(jiān)測(cè)HBV感染的重要標(biāo)志，而乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)則反映HBV有無復(fù)制及傳染性的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)主要通過分析HBV-M定量、HBV-DNA、淋巴細(xì)胞亞群在兩組患者中分布特點(diǎn)，比較兩組間差異，探討在兩組間的變化；同時(shí)分析HBsAg與HBV-DNA之間及HBsAg、HBV-DNA與淋巴細(xì)胞亞型之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2016年12月至2018年1月住院的慢性乙型肝炎患者45例及乙肝肝硬化患者35例為研究對(duì)象。慢性乙型肝炎組中男37例，女8例，年齡(32.11±10.54)歲。乙肝肝硬化組中男23例，女12例，年齡(50.00±11.99)歲。

1.2 方法

1.2.1 入組標(biāo)準(zhǔn) (1)診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》的慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并HAV、HCV、HDV、HGV等病毒性肝炎病毒感染；(2)其他原因(自身免疫性、藥物性、酒精性、中毒性等)肝病導(dǎo)致的慢性肝損傷；(3)妊娠或哺乳期婦女；(4)合并肝癌。

1.2.2 檢測(cè) HBV-M定量由南京金域檢驗(yàn)中心檢驗(yàn)；外周血淋巴細(xì)胞檢測(cè)：采集 EDTA 抗凝外周血，加入相應(yīng)的 CD45、CD3、CD4、CD8、CD56、CD19熒光標(biāo)記流式抗體，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血T淋巴細(xì)胞及其亞群、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞；HBV-DNA定量檢測(cè)采用ABI7300型自動(dòng)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)儀(美國(guó)AB Applied Biosystems公司生產(chǎn))，試劑購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，兩兩間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn), 檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HBV-M定量及HBV-DNA兩組患者間比較 乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(HBeAb)、HBV-DNA滴度在慢性乙型肝炎組、乙肝肝硬化兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；乙肝表面抗體(HBsAb)、乙肝核心抗體(HBcAb)在兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 淋巴細(xì)胞及亞型兩組間比較 乙肝肝硬化組的淋巴細(xì)胞總數(shù)、T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞絕對(duì)值較慢性乙型肝炎組下降，其中淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 慢性乙型肝炎與乙肝肝硬化HBV-M定量及HBV-DNA比較 M(P25,P75)

表2 慢性乙型肝炎組與乙肝肝硬化組淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及亞型的比較 M(P25,P75)

2.3 慢性乙型肝炎組HBsAg、HBV-DNA與淋巴細(xì)胞及亞型之間的相關(guān)性分析 HBsAg與淋巴細(xì)胞總數(shù)及各淋巴細(xì)胞亞型之間均無相關(guān)性，HBV-DNA與淋巴細(xì)胞總數(shù)及各淋巴細(xì)胞亞型之間亦無相關(guān)性。見表3。

表3 慢 性乙型肝炎組HBsAg、HBV-DNA與淋巴細(xì)胞及亞型的相關(guān)性

2.4 乙肝肝硬化組HBsAg、HBV-DNA與淋巴細(xì)胞及亞型之間的相關(guān)性分析 HBsAg與淋巴細(xì)胞總數(shù)及各淋巴細(xì)胞亞型之間均無相關(guān)性，HBV-DNA與淋巴細(xì)胞總數(shù)及各淋巴細(xì)胞亞型之間亦無相關(guān)性。見表4。

表4 乙 肝肝硬化組HBsAg、HBV-DNA與淋巴細(xì)胞亞型的相關(guān)性分析

2.5 慢性HBV感染患者HBV-DNA與HBsAg、HBeAg相關(guān)性分析 慢性HBV感染患者中HBV-DNA載量與HBsAg、HBeAg均呈正相關(guān)(r=0.338、0.336，P=0.011、0.011)。

3 討論

HBV感染呈世界性流行，我國(guó)是HBV感染的高發(fā)區(qū)，全球肝硬化患者中30%是由HBV感染引起，在我國(guó)更有多達(dá) 60%的肝硬化患者是由HBV感染引起[3]。因此對(duì)乙型肝炎的診斷、判斷病情、分析療效、評(píng)估轉(zhuǎn)歸是一個(gè)值得關(guān)注的問題。HBV感染是引起慢性肝病最常見的原因，病毒和機(jī)體兩方面的因素決定感染后的臨床轉(zhuǎn)歸。乙肝肝硬化是肝臟長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)和纖維化形成的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)主要研究HBV-M、HBV-DNA以及淋巴細(xì)胞亞型在慢性乙型病毒性肝炎、乙肝肝硬化中的分布差異。

HBV感染中HBV-M是監(jiān)測(cè)HBV感染的重要標(biāo)志，HBsAg是HBV感染的重要標(biāo)志，研究表明，HBsAg與肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)之間具有良好相關(guān)性，定量檢測(cè)HBsAg對(duì)預(yù)測(cè)抗病毒的治療療效有重要意義[4]， HBeAg 的轉(zhuǎn)歸則是治療有效最明顯的標(biāo)志，而 HBV-DNA 則反映有無復(fù)制和傳染性的強(qiáng)弱。本組研究結(jié)果顯示HBsAg、HBeAg、HBV-DNA在乙肝肝硬化組較慢性乙型肝炎組明顯降低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙型肝炎進(jìn)展為肝硬化過程中HBsAg、HBV-DNA逐漸下降, 這與裴彥禎等[5]及Wong等[6]的研究結(jié)果一致，主要因?yàn)橛捎贖BV侵入機(jī)體后，機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，從而造成肝細(xì)胞損害。隨著HBV感染時(shí)間的延長(zhǎng)，累積的免疫損傷也相應(yīng)加重，肝細(xì)胞破壞程度也越嚴(yán)重，造成的肝細(xì)胞壞死也越廣泛，進(jìn)而導(dǎo)致依賴于肝細(xì)胞的HBV復(fù)制減少，因此外周血HBV-DNA復(fù)制水平降低。同時(shí)，HBsAg和HBV復(fù)制一樣，也是依賴于肝細(xì)胞產(chǎn)生，以cccDNA為模板合成并組裝成完整的病毒顆粒后分泌至血液中，故肝細(xì)胞大量壞死也同樣導(dǎo)致HBsAg的合成與分泌減少[7]。故乙肝肝硬化患者HBV-DNA、HBsAg較慢性乙型肝炎明顯下降。慢性乙型肝炎進(jìn)展至乙肝肝硬化患者經(jīng)歷免疫清除期，患者在免疫清除期出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換，HBeAg轉(zhuǎn)陰，產(chǎn)生HBeAb，故乙肝肝硬化患者HBeAg較慢性乙型肝炎患者低，且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Wursthorn等[8]研究表明血清HBsAg的下降和肝內(nèi)HBV-DNA的下降速度平行，兩者呈正相關(guān), 然而Wiegand等[9]認(rèn)為HBsAg下降水平與HBV-DNA并不平行。本組研究表明HBsAg與HBV-DNA呈正相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)不高(r=0.338)，可能由于兩者都是依賴肝細(xì)胞產(chǎn)生，均以cccDNA為模板，組合成完整的Dane顆粒分泌至血液中有關(guān)。但HBsAg和HBV-DNA的合成和分泌路徑不完全相同，Dane顆粒內(nèi)含HBsAg、DNA、核心抗原(HBcAg)是病毒復(fù)制的主體，同時(shí)血液中還存在小球形顆粒，管型顆粒，后兩種顆粒由HBsAg組成不含DNA，就造成兩者的弱正相關(guān)性。外周血HBV-DNA載量是反映病毒感染和復(fù)制程度的重要指標(biāo)[10-11]，對(duì)判斷病毒復(fù)制程度，傳染性大小，抗病毒藥物療效等有重要意義。HBsAg和HBV-DNA定量水平存在相關(guān)性，在一定程度上HBsAg可反映HBV-DNA的復(fù)制情況。因此，可將治療前后的HBsAg水平變化作為療效評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，HBsAg 定量測(cè)定結(jié)合HBV-DNA定量結(jié)果可以更好地反映肝細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制及疾病的進(jìn)展情況，對(duì)于肝硬化嚴(yán)重程度的無創(chuàng)評(píng)估有重要意義。但在臨床工作中監(jiān)測(cè)判斷抗病毒治療是否有效時(shí)，單純依賴 HBsAg和HBV-DNA定量水平的變化是不夠的，肝臟影像學(xué)及病理學(xué)的檢查仍是非常必要的。HBeAg 水平高低是反應(yīng)病毒復(fù)制水平高低及傳染性強(qiáng)弱的標(biāo)志。本組研究表明HBeAg與HBV-DNA呈正相關(guān)，原因可能與兩者均可以反映機(jī)體內(nèi)病毒的復(fù)制水平相關(guān)。

乙型肝炎是一種免疫相關(guān)性疾病，機(jī)體感染HBV后并不直接對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，而是通過誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)間接損傷肝細(xì)胞[12-13]。T淋巴細(xì)胞是人體主要的免疫細(xì)胞，其數(shù)量的變化在一定程度上反映了機(jī)體的免疫水平。正常機(jī)體內(nèi) T 淋巴細(xì)胞及各亞群在不同的組織中有著不一樣的比例，而且相對(duì)穩(wěn)定[14]。人體T細(xì)胞由不同的亞群組成，由各亞群的數(shù)量、比例來調(diào)節(jié)和維持人體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，T細(xì)胞亞群紊亂是導(dǎo)致人體不能清除HBV病毒、慢性化及重癥化的主要原因[15]。同時(shí)，外周血T細(xì)胞亞群是反映HBV感染者免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[16]。有文獻(xiàn)[17]表明HBV感染后在體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡, 導(dǎo)致T細(xì)胞數(shù)量減少及亞群比例異常, 并隨病程進(jìn)展逐漸加重, 從而引起HBV感染慢性化及不同程度的肝細(xì)胞損傷。本研究中乙肝肝硬化組的淋巴細(xì)胞總數(shù)、T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞絕對(duì)值較慢性乙型肝炎組下降，其中淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明乙肝肝硬化患者機(jī)體T淋巴細(xì)胞免疫較慢性乙型肝炎組下降，可能與乙肝肝硬化患者經(jīng)歷免疫清除期后大量淋巴細(xì)胞被消耗相關(guān)。CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞分別代表兩類主要T細(xì)胞。CD4+T淋巴細(xì)胞因?yàn)榫哂休o助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能，所以被稱為輔助性T細(xì)胞，CD8+T淋巴細(xì)胞主要為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，可以識(shí)別并殺傷HBV感染的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示隨著病情由慢性乙型肝炎至肝硬化進(jìn)展，CD4+T淋巴細(xì)胞顯著性降低，提示乙肝肝硬化患者CD4+T淋巴細(xì)胞受損嚴(yán)重，說明在慢性HBV感染的過程中，CD4+T淋巴細(xì)胞降低，使其輔助體液免疫細(xì)胞的功能不足，以致其產(chǎn)生抗體和細(xì)胞毒性殺傷作用的功能減低，這可能為HBV感染慢性化的重要原因。同時(shí)在慢性HBV感染者中，由于CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯下降，導(dǎo)致HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞減少，使得HBV不能完全清除。CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少，可能導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降，感染乙肝病毒后不易清除，與疾病的慢性化有關(guān)，但是CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少并不能完全提示其功能上的降低[18]，因此仍需完善其功能方面的檢驗(yàn)分析其與肝炎轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。本組研究中T淋巴細(xì)胞總數(shù)及亞群水平與 HBV-DNA載量無相關(guān)性與李彩東等[19]研究結(jié)果一致，該研究認(rèn)為：機(jī)體的免疫功能障礙主要表現(xiàn)為免疫細(xì)胞功能缺陷，而非數(shù)量不足，這也許說明了HBV 感染者T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化與HBV-DNA載量沒有明顯相關(guān)性的原因。

綜上所述，本研究顯示HBsAg、HBeAg與 HBV-DNA定量水平隨著慢性乙型肝炎發(fā)展至肝炎肝硬化過程中逐漸下降，且在兩種疾病狀態(tài)中HBV-DNA載量與HBsAg、HBeAg均呈正相關(guān)，因此可將HBsAg、HBeAg與 HBV DNA結(jié)果相結(jié)合可更好地反映慢性乙肝的疾病進(jìn)展情況，對(duì)評(píng)價(jià)抗病毒藥物治療的療效和判斷預(yù)后有重要意義。同時(shí)臨床上可以通過檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群可以對(duì)疾病的進(jìn)展進(jìn)行評(píng)估，有利于了解機(jī)體的免疫功能，從而為抗病毒治療的指征、時(shí)機(jī)和療效預(yù)測(cè)提供依據(jù)。這些發(fā)現(xiàn)為慢性乙型肝炎患者的診斷及治療提供了良好的依據(jù)和思路。當(dāng)然本研究仍有不足之處，所選樣本量較小、未根據(jù)慢性乙肝疾病狀態(tài)進(jìn)行分組，及肝硬化Child評(píng)分進(jìn)一步分組等，在接下來的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中將更加優(yōu)化分組，更加全面詳細(xì)地了解在疾病進(jìn)展過程中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA、各組T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化，為臨床診療工作提供新思路。