李亞男， 馬曉峰， 王小英， 秦靜

蘭州大學第二醫(yī)院急診科(甘肅蘭州 730000)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史、以肝細胞內(nèi)脂肪過渡貯積為主要特征的臨床病理綜合征[1-2]。其發(fā)病率隨高脂血癥、肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征等疾病在全世界范圍的流行而不斷上升。目前NAFLD已成為慢性肝病的主要誘因，研究發(fā)現(xiàn)大約50%的NAFLD患者經(jīng)過4～13年發(fā)展會出現(xiàn)非酒精性脂肪肝炎(NASH)，40%發(fā)展為肝纖維化[3-4]。在臨床上由于其發(fā)病機制非常復雜，因此尚無理想藥物用于NAFLD的治療。但大量研究證明，腸道菌群在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，攝入乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡[5]，減少內(nèi)毒素的生成和吸收[6]，提高機體免疫力[7]，改善胰島素抵抗[8]，從而降低NAFLD風險的發(fā)生。在提高腸道益生菌菌群數(shù)量的效應(yīng)因子中，功能性寡糖被認為是重要的腸道功能調(diào)節(jié)劑，其中甘露寡糖更被重視，由于甘露寡糖會競爭性地與病原菌表面的外源凝集素相結(jié)合，削弱了病原菌與宿主腸道黏膜上皮細胞受體的結(jié)合，同時可對大腸桿菌、梭狀菌、沙門菌及溶血性糞桿菌等致病菌進行有效吸附[9]。2017年9—12月,本研究通過構(gòu)建高脂飲食的SD小鼠模型，觀察了乳桿菌聯(lián)合甘露寡糖對NAFLD的影響，從而為NAFLD的臨床治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 甘露寡糖(上海伯奧生物科技有限公司)；三酰甘油(TG)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)；膽固醇、膽酸鈉、丙硫氧嘧啶(上海生工有限公司)；包埋石蠟、伊紅Y(水溶性)、中性樹膠(國藥集團藥業(yè)股份有限公司)；無水乙酸鈉、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、吐溫-80等常規(guī)試劑(天津市凱信化學試劑有限公司)。

1.2 實驗動物 雄性清潔級健康SD小鼠50只，18～22 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物許可證號SYXK(豫) 2014-0005。

1.3 菌種及培養(yǎng)基 實驗用乳桿菌由本實驗室分離，采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為無水乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏10.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫-80 1 mL，溶于 1 000 mL 蒸餾水后121℃高壓滅菌備用。

1.4 高脂飼料配制 高脂飼料的配制方法參考謝慧臣等[10]提供的配方配制。其中基礎(chǔ)飼料占總重的82.3%，膽固醇、膽酸鈉、丙硫氧嘧啶分別占比2%、0.5%、0.2%，另外蔗糖和豬油分別占比7.5%、7.5%。

1.5 NAFLD小鼠模型分組 SD 大鼠被隨機分為5組，每組10只。分別為空白對照組(正常飲食)、模型組(高脂飲食)、乳桿菌組、甘露寡糖組(200 mg/kg)、乳桿菌+甘露寡糖組(200 mg/kg)，灌胃總體積1 mL，菌液濃度為1×109CFU/mL，空白對照組及模型組用生理鹽水取代。造模4周，造模期間自由飲食并記錄小鼠體重變化。所有造模小鼠干預10周后處死，收集肝臟及血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 乳桿菌菌液的制備 將分離的菌種接種于 MRS 液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)24 h，再以2%的接種量活化接種3次，9 000 r/min 離心 10 min，棄上清，采用比濁法在OD560下調(diào)整菌懸液濃度為1×109CFU/mL 備用。

1.7 血清生化檢測 采用摘除眼球法采血，EP管收集血液，室溫放置15 min后，3 000 r/min下離心10 min，收集血清，試劑盒檢測血清中TG、ALT和AST的變化。

1.8 肝臟組織學分析 取小鼠肝葉同一位置的肝組織大小約0.5 cm3，采用甲醛固定和石蠟包埋后，常規(guī)切片并經(jīng)HE染色，光鏡觀察并比較分析肝組織結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 實驗小鼠體重變化 在實驗10周后，肥胖模型小鼠的體重明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而單獨的乳桿菌組和甘露寡糖組與空白對照組之間差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但乳桿菌+甘露寡糖組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較，乳桿菌組和甘露寡糖組的小鼠在實驗10周后的體重變化差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且乳桿菌+甘露寡糖組小鼠體重的變化差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

組別n實驗前(g)10周后(g)凈增量(g)增長率(%)空白對照組1020.35±0.3626.87±1.546.52±0.7132.04±0.03模型組1020.92±1.4135.96±0.86??15.04±0.93??71.89±0.05??乳桿菌組1021.06±0.4930.66±1.29?△9.6±0.52?△45.58±0.05?△甘露寡糖組1019.98±0.6831.85±2.34?△11.87±1.22??△59.41±0.03??△乳桿菌+甘露寡糖組1020.77±1.2228.14±0.51△△7.37±0.66△△35.48±0.05△△

與空白對照組比較*P<0.05， **P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01

2.2 乳桿菌聯(lián)合甘露寡糖對模型動物血清血脂的影響 與空白對照組相比，模型組血清TG、AST、ALT 顯著升高(P<0.01)，乳桿菌組、甘露寡糖組或乳桿菌+甘露寡糖組小鼠因高脂飲食引起的肝臟損傷均見減輕(P<0.05)。與模型組相比，乳桿菌+甘露寡糖組小鼠血清中TG、AST、ALT的含量能更有效降低，且效果明顯優(yōu)于乳桿菌組或甘露寡糖組。見表2。

組別TG (mmol/L)ALT (U/L)AST (U/L)空白對照組1.42±0.2625.16±1.3888.98±3.41模型組2.68±0.42??34.65±2.91??139.53±5.70??乳桿菌組1.98±0.18?△30.82±1.67?△118.22±2.56?△甘露寡糖組2.14±0.13?31.06±1.25?125.14±6.18?乳桿菌+甘露寡糖組1.71±0.28?△29.54±1.16?△△98.41±4.82?△△

與正常對照組比較*P<0.05， **P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01

2.3 乳桿菌聯(lián)合甘露寡糖對NAFLD小鼠肝臟的改善作用 空白對照組肝臟正常，結(jié)構(gòu)清晰且無脂質(zhì)浸潤；模型組肝細胞腫大明顯，脂質(zhì)浸潤現(xiàn)象嚴重，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，產(chǎn)生了大量的脂肪性空泡。這種病理學變化在乳桿菌組、甘露寡糖組、乳桿菌+甘露寡糖組中均得到了一定的改善，肝小葉結(jié)構(gòu)獲得了一定的恢復，其中乳桿菌結(jié)合甘露寡糖對肝臟的改善效果最為明顯。見圖1。

3 討論

人體微生物組是一個巨大又復雜的微生物群落。它包括棲息在腸道內(nèi)腔的各種微生物-細菌、病毒、真菌、古生菌、噬菌體和原生動物[11]。腸道微生態(tài)作為人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，在長期進化的過程中形成了非常復雜的作用特性，而且與人體的各種生理病理代謝過程聯(lián)系緊密[12-13]。研究表明腸道微生物組的成分和功能與生活地點、個體的年齡性別、種族和飲食攝入有關(guān)，同時Rothschild等[14]證實腸道菌群群落結(jié)構(gòu)主要由環(huán)境因素決定，而且只有1.9%的腸道微生物組是可遺傳的，超過腸道微生物組β-多樣性20%的差異是由個人飲食和生活習慣所導致的。越來越多的研究證明腸道微生物的變化在個體的各種發(fā)病機制中占有重要地位。雖然健康個體的腸道菌群成分高度不同，但患有肥胖、糖尿病、高血脂、代謝障礙及部分癌癥的個體均具有菌群豐富度低的特點[15]。同時大量相關(guān)研究暗示了特定菌門、菌綱或菌種或細菌代謝活動可能會對個體的發(fā)病有益或有害，但嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus)與空腹血糖和HbA1c水平正相關(guān)[16-17]。而甘露寡糖作為功能性寡糖在促進嗜酸乳桿菌及雙歧桿菌的增殖中具有非常重要的作用。因此通過乳桿菌與甘露寡糖的聯(lián)合，將進一步體現(xiàn)其臨床意義和研究價值。

在人體的代謝系統(tǒng)中，肝臟在解剖學上與腸道密切相關(guān)，通過門靜脈循環(huán)與腸道相互影響[18-19]。因此通過調(diào)整腸道菌群將有效預防和改善各種肝病的發(fā)生發(fā)展，通過益生菌結(jié)合功能性寡糖來提高腸道有益菌群的數(shù)量，為改善肝臟的代謝和分析肝臟與腸道菌群之間的關(guān)系提供提供依據(jù)。本研究通過觀察乳桿菌結(jié)合甘露寡糖對非酒精性脂肪肝小鼠的影響發(fā)現(xiàn)，在改善動物腸道菌群后，將有效改善肝臟結(jié)構(gòu)，恢復部分肝臟功能，控制小鼠體重，在血清血脂中的酶及TG指標能獲得有效控制，研究數(shù)據(jù)證明腸道微生態(tài)與肝臟代謝有密切關(guān)系。同時通過組間比較分析發(fā)現(xiàn)，益生菌結(jié)合甘露寡糖的作用效果明顯優(yōu)于單獨的益生菌或甘露寡糖作用，因此為后期的相關(guān)機制研究提供了直接依據(jù)，也為后期臨床NAFLD的防治提供了思路與參考。

A：空白對照組；B：模型組；C：乳桿菌組；D：甘露寡糖組；E：乳桿菌+甘露寡糖組

圖1乳桿菌及甘露寡糖對小鼠肝臟病理學的影響(HE，×400)