吳滿意

（皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院，安徽 蕪湖 241004）

0 引言

近年來，我國(guó)大多數(shù)男性出現(xiàn)了許多不健康的生活方式，例如：抽煙、喝酒、長(zhǎng)時(shí)間熬夜、不健康性行為等，造成我國(guó)男性的不育概率在近年內(nèi)有了明顯上升的趨勢(shì)[1]。對(duì)于一些因男方不育而無法正常生育但卻想要孩子的家庭來說，人工授精是最佳的方法，精子優(yōu)選是人工授精工作中一個(gè)重要的步驟，其目的在于通過分離技術(shù)，選出質(zhì)量佳的精子進(jìn)行人工授精，進(jìn)而提高授精的成功率[2]。在優(yōu)選分離的過程中，除了通過降低分離技術(shù)對(duì)精子的傷害來提高精子質(zhì)量外，臨床研究顯示加入水溶性維生素E也可有效提高精子分離后的質(zhì)量[3]。本次研究通過對(duì)比分析的方法，對(duì)比了單一分離和加入水溶性維生素E進(jìn)行分離對(duì)精子質(zhì)量的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究中，選取2017年6月至2018年6月在我院接受不育治療的40例男性患者的新鮮精液，將每例精液均分為4份，每份各包括40例精液，每2份為一組，共分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)組別?；颊吣挲g23-33歲，平均（28.30±1.50）歲，所選取的患者均與女性配偶有1年或以上的未采取避孕措施的性行為，但女方未見任何懷孕跡象，且女方經(jīng)身體檢查，未患有不孕癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除近期發(fā)生身體感染、全身性疾病、腎功能衰竭、3個(gè)月內(nèi)有發(fā)熱及用藥情況、有長(zhǎng)期不良環(huán)境暴露史、1周內(nèi)有性行為的患者。采集后的精液進(jìn)行毒性測(cè)試顯示合格后，保存于安全容器內(nèi)，檢測(cè)顯示患者的精液濃度均＞20×106/mL，患者前向運(yùn)動(dòng)的精子率均＞32%，患者精子的形態(tài)正常率均≥4%。

1.2 方法

（1）對(duì)照組精子分離方法。對(duì)照組的2份精液分別通過上游法和密度梯度法進(jìn)行分離，具體方法如下。

①上游法：采用Quinn’s Sperm Washing Medium 上游離心洗滌，取一只干凈試管，向其中加入1 mL精液和1.5 mL Washing培養(yǎng)液，讓試管在保持45°傾斜的情況下于37℃條件下進(jìn)行1 h的孵育，另取一干凈試管，將1.2 mL的上層液體加入其中，再加入2 mL的Washing培養(yǎng)液，在200 g的條件下進(jìn)行8 min的離心操作后將上清液去除，最后，將精液重懸于0.5 mL的Washing培養(yǎng)液中，在37℃的條件下進(jìn)行0.5 h的孵育。

②密度梯度法：采用PureCeption密度梯度離心法，濃度分別為80%和40%，取一干凈錐底管，向其中加入1 mL密度梯度液（80%）后，在其上方緩慢滴加1 ml密度梯度液（40%），再在最上層加入1 mL精液，在300×g的條件下進(jìn)行20 min的離心操作后將上清液去除，最后，將精液重懸于0.5 mL的Washing培養(yǎng)液，在37℃的條件下進(jìn)行0.5 h的孵育。

（2）實(shí)驗(yàn)組精子分離方法。實(shí)驗(yàn)組的2組精液選取的分離方法與對(duì)照組相同，并在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加入一定濃度的水溶性維生素E。具體方法如下。

①上游法：使用Quinn’s Sperm Washing Medium的Washing液，并向其中加入水溶性維生素E（濃度為30-240μmol·L-1），其余操作與對(duì)照組相同，只需將對(duì)照組中加入的Washing液更換為滴加了水溶性維生素E的Washing液即可。

②密度梯度法：采用PureCeption密度梯度離心法，濃度分別為80%和40%，其余操作與對(duì)照組相同，并各向其中加入水溶性維生素E（濃度為30-240μmol·L-1），只需將對(duì)照組中加入的Washing液更換為滴加了水溶性維生素E的Washing液即可。

1.3 觀察指標(biāo)

通過對(duì)比兩組精子在分離后0 h和24 h的前向運(yùn)動(dòng)精子率、活動(dòng)精子率，以及獲能0 h和2 h后酪氨酸磷酸化水平，從而對(duì)分離效果進(jìn)行有效評(píng)價(jià)。其中前向運(yùn)動(dòng)精子率、活動(dòng)精子率通過計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析，精子活動(dòng)指數(shù)＝孵育后活動(dòng)精子率/孵育前活動(dòng)精子率[4]；精子獲能0 h和2 h后酪氨酸磷酸化水平的檢測(cè)，利用酪氨酸磷酸化抗體熒光標(biāo)記物檢測(cè)精子尾部TP狀況[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，將均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差作為計(jì)量資料（精子活力情況、獲能0 h和2 h后酪氨酸磷酸化水平）等的表示方法，t作為組間數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)。進(jìn)行比較后得出P，當(dāng)P＜0.05時(shí)，數(shù)據(jù)處理結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義明顯。

2 結(jié)果

2.1 分離后0 h、24 h精子活力情況

實(shí)驗(yàn)組精子在分離后0 h、24 h的前向運(yùn)動(dòng)精子率、活動(dòng)精子率均優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05），詳見表1。

表1 分離后0 h、24 h精子活力情況（±s）

表1 分離后0 h、24 h精子活力情況（±s）

注：*t=3.0564，*P=0.0013；#t=13.3158，#P=0。

上游法 密度梯度法實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組0 h前向運(yùn)動(dòng)精子（%） 79.69±9.26 63.75±9.82 62.76±11.45 47.99±12.89 24h h前向運(yùn)動(dòng)精子（%）指標(biāo)組別55.88±38.06 30.01±14.73 50.93±16.08 27.74±10.57 0 h活動(dòng)精子（%） 90.06±8.03 81.03±7.68 89.12±9.18 83.50±13.18 24 h活動(dòng)精子（%） 77.68±41.60 46.32±17.88 66.46±17.69 42.95±14.51精子活動(dòng)指數(shù) 0.85±0.54* 0.57±0.21* 0.97±0.21# 0.45±0.13#

2.2 精子獲能0 h和2 h后酪氨酸磷酸化水平

實(shí)驗(yàn)組獲能0 h和2 h后酪氨酸磷酸化水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），詳見表2。

表2 精子獲能0 h和 2h后酪氨酸磷酸化水平（±s）

表2 精子獲能0 h和 2h后酪氨酸磷酸化水平（±s）

注：*t=2.1356，*P=0.0359；#t=2.1686，#P=0.0332。

指標(biāo)組別上游法 密度梯度法實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組獲能0 hTP（%） 6.22±7.07 5.09±6.21 9.76±9.86 7.84±8.13獲能2 hTP（%） 14.33±12.53 10.62±9.39 18.98±14.83 13.84±11.58△ TP（%） 8.10±5.66* 5.71±4.25* 9.32±8.09# 6.00±5.32#

3 討論

精子優(yōu)選的目的是選出高質(zhì)量的精子，因此通過有效的手段來提高精子優(yōu)選工作的效率十分必要[6]。水溶性維生素E苯環(huán)上的酚羥基被乙?；?，酯水解為酚羥基后為生育酚。生育酚能促進(jìn)性激素分泌，使男子精子活力和數(shù)量增加[7-8]。本次研究通過對(duì)比分析的方法，驗(yàn)證了水溶性維生素E可在精子優(yōu)選過程中提高精子質(zhì)量這一事實(shí)。

綜上所述，在精子優(yōu)選分離的過程中，向其中加入水溶性維生素E，可以有效改善分離后的精子質(zhì)量，因此，值得推廣。