張 卉 祖淑靜 張 寧 單 飛 李 卓 項(xiàng) 丹

黑龍江省哈爾濱市紅十字中心醫(yī)院(150076)

我國(guó)新生兒中出生缺陷率約為5.6%[1]，產(chǎn)前診斷為預(yù)防出生缺陷的有效手段，胎兒羊水細(xì)胞培養(yǎng)和G帶核型分析，是目前常用的介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)[1]。以染色體體微陣列(CMA)和第二代測(cè)序(NGS)技術(shù)為代表的高通量基因檢測(cè)技術(shù)用于產(chǎn)前診斷取得成功，特別是確診某些致死和致殘的亞顯微水平基因組拷貝異常疾病[2-4]。本研究通過對(duì)具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦行羊膜腔穿刺術(shù)，在應(yīng)用傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析同時(shí)采用NGS技術(shù)檢測(cè)，探討NGS技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2015年1月—2016年6月在本院產(chǎn)前診斷中心就診、有產(chǎn)前診斷指征的孕婦共244例，指證包括高齡(年齡≥35歲)、血清學(xué)唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)、外周血胎兒游離DNA檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)和超聲顯示胎兒異常。年齡(33.2±5.0歲)(16～46歲)，孕齡16～24周。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.2.1 標(biāo)本采集 檢測(cè)前對(duì)納入研究的孕婦夫婦遺傳咨詢并簽署知情同意書。孕周16～24周時(shí)行羊膜腔穿刺術(shù)，染色體核型分析及高通量測(cè)序分析。

1.2.2 染色體核型分析 將抽取的羊水常規(guī)離心，制細(xì)胞懸液，培養(yǎng)，G顯帶，收集貼壁活細(xì)胞制片(按湖南湘雅醫(yī)院國(guó)家重點(diǎn)遺傳實(shí)驗(yàn)室方法操作)常規(guī)制片G顯帶。鏡下觀察、計(jì)數(shù)細(xì)胞的中期分裂相，分析3～5個(gè)核分裂相，異常核型計(jì)數(shù)50～100個(gè)。根據(jù)《2013年版人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN 2013)》描述染色體異常核型[5-6]。

1.2.3 NGS技術(shù) 采集羊水10ml密閉，4℃保存及運(yùn)輸，48h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室處理；提取羊水細(xì)胞，自主創(chuàng)新的快速簡(jiǎn)易EZ-GALODNA建庫(kù)；測(cè)序采用Hiseq2500；生物信息學(xué)分析采用RUPA比對(duì)方法。DNA測(cè)序查詢DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及Pub Med公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)檢測(cè)的DNA序列，計(jì)算樣本染色體序列含量。通過生物信息學(xué)分析，計(jì)算每條染色體覆蓋深度值，并轉(zhuǎn)化為染色體異常風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)。每條染色體DNA(chr N)上所占總DNA比例即可標(biāo)識(shí)為覆蓋深度Cov-chr N，以此判斷樣本胎兒染色體拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)染色體數(shù)目異常分析

兩種方法分析染色體數(shù)目異常一致20例，異常檢出率為8.9%(20/244)(表1)，不包括染色體的倒位、易位、隨體、異染色體h＋等染色體結(jié)構(gòu)異常。2例細(xì)胞培養(yǎng)失敗行高通量測(cè)序，結(jié)果為1例18-三體引產(chǎn)，1例正常出生隨訪新生兒正常。

2.2 兩種方法檢測(cè)染色體畸變分析

244例行高通量測(cè)序，染色體畸變陽性率(有致病性包括數(shù)目異常)為11.9%(29/244)，多態(tài)性和致病性不明確56.2%(137/244)。微缺失/微重復(fù)117例，其中明確意義的突變28例(包括數(shù)目異常)；臨床意義不明的拷貝數(shù)目變異109例(多態(tài)性)，最終比染色體核型分析多檢測(cè)出4例意義明確的染色體微缺失/微重復(fù)病變，而染色體結(jié)構(gòu)異常(3例倒位、1例易位)行高通量測(cè)序未檢測(cè)到，見表2。

表1 兩種方法分析對(duì)比及妊娠結(jié)局

表2 羊水細(xì)胞染色體核型分析與高通量測(cè)序?qū)Ρ燃疤航Y(jié)局

(接上表)

3 討論

3.1 兩種方法對(duì)染色體數(shù)目異常檢出效果

染色體核型分析是目前產(chǎn)前診斷技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠檢出染色體數(shù)目或大的結(jié)構(gòu)異常。但存在檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)羊水細(xì)胞培養(yǎng)要求較高，分辨率低，主觀性較強(qiáng)，一般能發(fā)現(xiàn)10Mb以上的缺失/重復(fù)，無法對(duì)染色體亞顯微結(jié)構(gòu)變異—染色體10Mb以下的微重復(fù)/微缺失進(jìn)行檢測(cè)。而高通量測(cè)序技術(shù)，能夠提供快速、簡(jiǎn)便、高通量檢測(cè)染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的改變。在高通量測(cè)序技術(shù)成熟與發(fā)展中，全基因組測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域，尤其是在遺傳性疾病的研究上受到關(guān)注。目前人類已知疾病中約有4000多種與基因異常有關(guān)[7]。傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)僅能檢測(cè)5Mb以上的缺失和重復(fù)，5Mb以下隱藏著眾多的微小不平衡，這些微小重排可引起高達(dá)15%的人產(chǎn)生染色體綜合征。如孕婦B超示胎兒大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位室間隔缺損，但羊水核型分析結(jié)果正常，應(yīng)用高通量測(cè)序檢測(cè)胎兒11q24.1q25區(qū)段存在12.1Mb缺失。染色體微缺失綜合征也能引起智力低下[8]。故對(duì)染色體微缺失、微重復(fù)等檢測(cè)有一定臨床意義。

3.2 高通量測(cè)序技術(shù)的局限性

本研究244例樣本中，染色體數(shù)目異常中NGS檢測(cè)與染色體核型分析結(jié)果一致20例。而染色體結(jié)構(gòu)異常4例(3例9號(hào)染色體臂間倒位和1例易位)應(yīng)用NGS未能檢測(cè)出。一般認(rèn)為，染色體異染色質(zhì)區(qū)的多態(tài)性改變不會(huì)導(dǎo)致臨床疾病[9]。這在測(cè)序中的對(duì)應(yīng)解釋就是異染色質(zhì)區(qū)域多數(shù)為高度重復(fù)DNA序列，并不包含可表達(dá)的基因，出現(xiàn)在此區(qū)域的染色體變異為重復(fù)序列的DNA增減造成，并不表現(xiàn)出已知的臨床癥狀[10]。9號(hào)染色體臂間倒位也是最常見的染色體結(jié)構(gòu)異常，并不產(chǎn)生臨床癥狀。因此，inv(9)的倒位發(fā)生在異染色質(zhì)區(qū)內(nèi)或區(qū)外，測(cè)序技術(shù)可進(jìn)一步確定[11]。

3.3 高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

目前常規(guī)G帶分析無法檢測(cè)到10 Mb以下的染色體異常，而高通量測(cè)序檢測(cè)能準(zhǔn)確做出判斷。與細(xì)胞培養(yǎng)核型分析相比，高通量測(cè)序技術(shù)因具有的特異性、敏感性在檢測(cè)染色體數(shù)目異常上與其有較高的一致性，且能精確分析。由于不需羊水細(xì)胞培養(yǎng)，減少了培養(yǎng)失敗的可能性，具有快速檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，利用Hiseq2500測(cè)序快速得到結(jié)果。本研究244例中有2例細(xì)胞培養(yǎng)失敗，但高通量測(cè)序結(jié)果避免了復(fù)穿。有3例倒位、1例平衡易位，因其細(xì)胞內(nèi)的核酸數(shù)量無改變，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)未能檢測(cè)出異常。今后有望通過改變測(cè)序深度對(duì)平衡易位/倒位進(jìn)行檢測(cè)，但面臨成本高昂，技術(shù)難度大，樣本DNA質(zhì)量要求高等問題，目前臨床難以普及應(yīng)用[12]。

3.4 染色體核型分析與高通量測(cè)序在胎兒異常病因?qū)W研究中作用

本研究中遺傳因素1例6p24.3缺失0.22Mb，唇裂(分娩)；11例引產(chǎn)中有1例1q21.2重復(fù)0.42，胎死宮內(nèi)(胎兒全身水腫，胸腔積水引產(chǎn))；1例4p16.1重復(fù)0.94Mb，14q11.2缺失0.3 Mb(胎兒?jiǎn)涡姆繂涡氖乙a(chǎn))；1例7q11.22重復(fù)0.46Mb(胎兒生長(zhǎng)受限引產(chǎn))；1例14q32.33重復(fù)0.32Mb(臍膨出引產(chǎn))；1例21q21.1q21.2重復(fù)0.88Mb(胎兒頸部水腫，骨發(fā)育不良引產(chǎn))；1例Yq11.22重復(fù)0.48Mb，16q23.1重復(fù)0.6Mb(分娩后新生兒關(guān)節(jié)彎曲，不會(huì)吸允夭折)。檢測(cè)出的微缺失/微重復(fù)是否與胎兒異常有關(guān)，因病例數(shù)不足尚需積累病例驗(yàn)證。常見遺傳性疾病的發(fā)病機(jī)制有多種，如點(diǎn)突變、拼接位點(diǎn)突變、小片段插入/缺失突變、基因重復(fù)、外顯子缺失/重復(fù)突變和復(fù)雜重排及基因拷貝數(shù)異常等，如心血管系統(tǒng)的先天性心臟病[13]、生殖系統(tǒng)的男性無精子癥和少弱精子癥[14]、神經(jīng)系統(tǒng)的智力障礙和孤獨(dú)[15]、胎兒顱內(nèi)間隙異常[16]、遲發(fā)型脊椎骨骺發(fā)育不良[17]、先天性唇腭裂[18]以及地中海貧血[19]等病因均為染色體微缺失或微重復(fù)。目前應(yīng)用高通量基因檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了許多與出生缺陷相關(guān)的遺傳學(xué)和基因組變異[20]。在對(duì)幾十萬至幾百萬個(gè)DNA分子測(cè)序同時(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)每個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全面細(xì)致分析。通過改變測(cè)序深度，即可對(duì)染色體不同大小的缺失/重復(fù)檢測(cè)，以診斷所引起的各種出生缺陷。高通量測(cè)序技術(shù)能很好地檢測(cè)出微小的染色體異常，而微小的染色體異?？赡艽嬖谟泄δ芑?，這為預(yù)測(cè)疾病候選基因提供依據(jù)，在產(chǎn)前診斷中具有一定價(jià)值。

總之，高通量測(cè)序技術(shù)能檢測(cè)出100kb微缺失微重綜合征，與其發(fā)病率相比是否有價(jià)值還需探討。對(duì)胎兒異常的病因?qū)W是否能做出更多的貢獻(xiàn)，也需要大樣本、多中心研究。

(致謝：本文得到云南省第一人民醫(yī)院朱寶生教授的建議和指導(dǎo)，在此表示感謝!)