張東方 王 茜 李治國 陳 燕

1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院(唐山，063000)；2.河北省唐山市開灤總醫(yī)院；3.河北省唐山市婦幼保健院；4.華北理工大學(xué)

水通道蛋白3(AQP3)是水通道蛋白家族(AQPs)的亞型之一，負(fù)責(zé)水、甘油等小分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運，涉及廣泛的生理功能和多種人類相關(guān)疾病。目前國內(nèi)外少數(shù)研究表明，在人類胎盤、胎膜中均有AQP3表達(dá)，其與妊娠期高血壓疾病可能存在相關(guān)性。本研究通過檢測AQP3在重度子癇前期患者胎盤組織中的定位及其m RNA和蛋白的表達(dá)水平，探討其與子癇前期的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年10月—2018年9月于本院住院的60例重度子癇前期患者為研究對象(重度子癇前期組)，選取同期正常足月妊娠婦女60例(正常妊娠組)為對照。納入條件：符合重度子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；足月單胎妊娠；無其他妊娠合并癥。排除條件：既往存在心、肝、肺、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病病史。兩組對象均為剖宮產(chǎn)分娩，正常妊娠組孕婦因瘢痕子宮、胎位異常、狹窄骨盆等因素實施剖宮產(chǎn)手術(shù)。所有孕婦對本研究均知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 胎盤娩出后，立即剪取3份直徑約2cm無梗死、出血及鈣化區(qū)域的胎盤組織，生理鹽水清洗，其中1份放入10%中性福爾馬林液中固定24h后送病理，用于免疫組化檢測；其余2份放入凍存管中，冷藏運送，液氮中保存，用于qRT-PCR及Western blotting實驗。

1.2.2 qRT-PCR檢 測AQP3 m RNA表達(dá)水平 采用Trizol試劑盒法(賽默飛世爾科技中國有限公司)提取胎盤組織總RNA，使用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度。參照試劑盒說明書將m RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA行RT-PCR檢測，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線分析法計算各組AQP3 m RNA相對表達(dá)量。

1.2.3 Western blotting檢測AQP3蛋白表達(dá)水平按照蛋白提取試劑盒(北京百奧萊博科技公司)說明書方法提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。應(yīng)用軟件Image J分析條帶灰度值。

1.2.4 免疫組化檢測(SP法)AQP3定位 常規(guī)石蠟組織標(biāo)本切片、脫蠟，微波抗原修復(fù)，0.9%H2O2甲醇溶液阻斷過氧化物酶活性，山羊血清室溫孵育30min，一抗(濃度1：200)孵育過夜，二抗(濃度1：200)室溫孵育30min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育40min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，淡氨水返藍(lán)，樹脂封片，顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗，以已知陽性組織為陽性對照。統(tǒng)計5個400倍圖像視野陽性細(xì)胞檢出率和細(xì)胞染色強(qiáng)度，兩者分值相乘為陽性程度判斷標(biāo)準(zhǔn)：0分為陰性(－)，1～4分為弱陽性(＋)，5～8分為陽性(＋＋)，9～12分為強(qiáng)陽性(＋＋＋)。染色強(qiáng)度計分：淺黃色1分，棕色2分，褐黃3分。陽性細(xì)胞檢出率：0～5%0分，6%～25%1分，26%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以(±s)表示，組間比較應(yīng)用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以[M(P25，P75)]表示，應(yīng)用Mann-Whitney秩和檢驗。P＜0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

兩組對象年齡、孕次、產(chǎn)次、孕期體質(zhì)量指數(shù)(BMI)增長比較無差異(P＞0.05)。重度子癇前期組收縮壓和舒張壓高于正常妊娠組，新生兒體重低于正常妊娠組(均P＜0.001)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 胎盤組織中AQP3 m RNA相對表達(dá)

AQP3 m RNA在重度子癇前期組中的相對表達(dá)量(0.81±0.70)低于正常妊娠組(1.45±0.18)，P＜0.05。

2.3 胎盤組織中AQP3蛋白的相對表達(dá)

重度子癇前期組胎盤組織中AQP3蛋白相對表達(dá)量(0.53±0.06)低于正常妊娠組(0.83±0.02)，P＜0.05。見圖1。

2.4 胎盤組織中AQP3的定位

重度子癇前期組AQP3蛋白的表達(dá)較正常妊娠組低(Z＝-6.98，P＜0.05)，見表2，圖2。

圖1 AQP3蛋白在不同組別胎盤組織中的相對表達(dá)

表2 AQP3蛋白在兩組胎盤組織中的表達(dá)

圖2 AQP3在重度子癇前期和正常妊娠胎盤組織中的定位表達(dá)(SP染色，×200)

3 討論

AQPs是一種能夠轉(zhuǎn)運水分子，在細(xì)胞膜上形成孔的整體膜蛋白[2]。與經(jīng)典的水通道相反，AQP3除了轉(zhuǎn)運水之外，還可以輸送其它一些不帶電荷的小分子，如甘油和尿素等[3]。據(jù)報道，AQP3介導(dǎo)的甘油轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、脂肪細(xì)胞代謝和表皮水分保留；AQP3缺乏使細(xì)胞甘油代謝和生物合成受損，降低ATP含量和抑制AMP激酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在正常人胎盤、胎膜中均有AQP3表達(dá)，且在胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)[5-6]。

子癇前期是多因素、多通路、多機(jī)制致病的綜合征，發(fā)病機(jī)制最主要的一個學(xué)說就是胎盤缺氧學(xué)說：滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力異常，子宮螺旋小動脈重鑄障礙而導(dǎo)致的胎盤血管功能異常和內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7]。胎盤絨毛中的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡在正常妊娠期間逐漸增加，并且在病理性胎盤中，如子癇前期顯著增加[8]。凋亡加劇可能導(dǎo)致合體滋養(yǎng)細(xì)胞功能的改變，包括AQPs在內(nèi)的各種轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，其中涉及胎盤AQP3異常表達(dá)。Alejandra等[9]實驗表明，胎盤AQP3的表達(dá)改變可能導(dǎo)致子癇前期等胎盤源性疾病。但AQP3在子癇前期中的作用機(jī)制目前并不清楚。本研究顯示在重度子癇前期胎盤中AQP3 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低。Szpilbarg等[10]研究，雖然標(biāo)本量只有13例，但結(jié)果與本研究結(jié)果一致，可能是胎盤為減少滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡而產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)。

此外，Hoogewijs等[11]在研究中證實體內(nèi)AQP3表達(dá)水平受氧的依賴性調(diào)節(jié)。Szpilbarg等[12]將正常胎盤的外植體在常氧、缺氧和缺氧/復(fù)氧的條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AQP3在缺氧條件下表達(dá)降低。分析認(rèn)為，子癇前期胎盤血液灌注不足，胎盤缺血缺氧，導(dǎo)致缺血/再灌注損傷，胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜可能受損，從而可能導(dǎo)致胎盤AQP3表達(dá)下調(diào)。母體與胎兒間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運主要通過跨細(xì)胞途徑，AQP3等膜蛋白可能參與了母體與胎兒間的代謝物、離子和水的運輸[13]。AQP3表達(dá)降低可能對母胎間物質(zhì)轉(zhuǎn)運產(chǎn)生不利的影響。

也有研究表明AQP3參與氧化應(yīng)激，其介導(dǎo)的甘油和脂質(zhì)代謝異常，脂質(zhì)及其過氧化物損傷血管內(nèi)皮，進(jìn)而引發(fā)子癇前期的一系列癥狀。Zhu等[13]發(fā)現(xiàn)，AQP3通過促進(jìn)水和甘油轉(zhuǎn)運以及巨噬細(xì)胞吞噬、遷移活性，參與先天免疫，AQP3表達(dá)異?？赡芤l(fā)巨噬細(xì)胞的功能異常，導(dǎo)致母胎界面的炎癥免疫反應(yīng)的過度激活，從而引發(fā)子癇前期。

綜上所述，AQP3在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用，可能與子癇前期胎盤組織缺氧或者胎盤適應(yīng)性的調(diào)節(jié)有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實。