袁明明，任曉燕，陶玉梅，陳婷婷，蔡南南，金曉霞，衛(wèi)穎澤，何松△

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的癌癥之一，占所有女性癌癥的25%，發(fā)達(dá)國(guó)家的乳腺癌發(fā)病率較高，且較不發(fā)達(dá)國(guó)家的相對(duì)死亡率較高［1］。2011年St.Gallen國(guó)際乳腺癌會(huì)議將乳腺癌分為五種分子分型：Luminal A型、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）陰 性Luminal B型、HER-2陽(yáng)性Luminal B型、HER-2過(guò)表達(dá)型、三陰型，近年來(lái)此分型系統(tǒng)進(jìn)一步完善，并根據(jù)不同分子類型推薦不同的治療方案［2］。P53作為迄今發(fā)現(xiàn)與人類癌癥最相關(guān)的抑癌基因之一，其基因突變存在于50%的人類癌癥中，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3］。本研究通過(guò)回顧性分析709例浸潤(rùn)性乳腺癌患者資料，分析P53的表達(dá)及其與分子分型、組織學(xué)類型、分級(jí)及雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、HER-2等生物學(xué)標(biāo)志物之間的關(guān)系，以期對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌的臨床結(jié)果預(yù)測(cè)及個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 收集南通市腫瘤醫(yī)院病理科2015年1月—2017年12月存檔的浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本709例，所有病例術(shù)前均未行放療、化療等任何治療。本組病例均為女性，年齡22～89歲，中位年齡54歲。所用P53（DO-7/鼠單克隆抗體，稀釋度1∶600）、ER（EP1/兔單克隆抗體，稀釋度1∶400）及PR（EP2/兔單克隆抗體，稀釋度1∶1 200）一抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，HER-2（A0485/兔多克隆抗體，稀釋度1∶800）、Ki-67（MIB-1/鼠單克隆抗體，稀釋度 1∶600）及EnVision試劑盒購(gòu)自DAKO公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm 厚切片。P53、ER、PR、HER-2及 Ki-67均在DAKO Omnis全自動(dòng)免疫組化染色儀上采用EnVision（二步法）完成，操作步驟按照操作手冊(cè)及試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。Ki-67使用檸檬酸鹽修復(fù)液修復(fù)抗原，其余指標(biāo)均采用EDTA修復(fù)。所有標(biāo)本均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。ER、PR以正常子宮內(nèi)膜組織作陽(yáng)性對(duì)照，P53、HER-2以乳腺癌已知陽(yáng)性組織作對(duì)照，Ki-67以正常闌尾組織作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。子宮內(nèi)膜組織取自于子宮切除術(shù)患者標(biāo)本，闌尾組織取自闌尾切除術(shù)患者標(biāo)本，取材步驟參照《臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊(cè)》。

1.3 結(jié)果判定 所有標(biāo)本在浸潤(rùn)性乳腺癌區(qū)域出現(xiàn)定位明確的棕黃色或棕褐色顆粒判定為特異性陽(yáng)性反應(yīng)。P53、ER、PR、Ki-67陽(yáng)性定位在細(xì)胞核，HER-2陽(yáng)性定位在細(xì)胞膜。P53參考Allred［4］判定標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，弱為1分，中等為2分，強(qiáng)為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：＜1%為1分，1%～10%為2分，11%～35%為3分，36%～65%為4分，＞65%為5分。兩項(xiàng)分值相加的結(jié)果為最終評(píng)分：0～5分為低表達(dá)組，6～8分為高表達(dá)組。ER、PR、HER-2的免疫組化染色評(píng)分參照2013年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）/美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)（CAP）推薦的ER、PR、HER-2評(píng)估的更新指南，ER、PR以1%作為陽(yáng)性表達(dá)的臨界值，HER-2以＞10%浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色定義為陽(yáng)性（3+），0和1+定義為陰性反應(yīng)。HER-2免疫組化評(píng)分為2+的標(biāo)本均再行熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)有無(wú)HER-2基因擴(kuò)增，分別納入HER-2陽(yáng)性組和陰性組。

1.4 分型標(biāo)準(zhǔn) 組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)及組織學(xué)分級(jí)參照2012年乳腺腫瘤WHO分類，分子分型標(biāo)準(zhǔn)參照St.Gallen國(guó)際乳腺癌會(huì)議共識(shí)［2］，采用免疫組織化學(xué)替代分型，見(jiàn)表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類變量組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩變量相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 The St.Gallen international expert consensus of classification subgroups of breast cancer表1 St.Gallen國(guó)際乳腺癌會(huì)議分子分型共識(shí)

2 結(jié)果

2.1 P53、ER、PR、HER-2及Ki-67在乳腺癌中的表達(dá) 709例浸潤(rùn)性乳腺癌中P53高表達(dá)者占26.8%（190/709）（圖1A），低表達(dá)者占73.2%（519/709）（圖1B）。ER陽(yáng)性率58.3%（413/709）（圖1C）。PR陽(yáng)性率 52.5%（372/709）（圖1D）。HER-2陽(yáng)性者占25.7%（182/709）（圖1E）。Ki-67增殖指數(shù)≤30%者占 70.5%（500/709），＞30% 者占 29.5%（209/709）（圖1F）。

Fig.1 Expressions of P53,ER,PR,HER-2 and Ki-67 in invasive breast cancer(×200)圖1 浸潤(rùn)性乳腺癌中P53、ER、PR、HER-2和Ki-67的表達(dá)（×200）

2.2 P53表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 依據(jù)免疫組化結(jié)果對(duì)709例浸潤(rùn)性乳腺癌病例進(jìn)行分子分型：Luminal A 型者占 27.8%（197/709），HER-2陰性Luminal B型者占 26.7%（189/709），HER-2陽(yáng)性Luminal B型者占9.0%（64/709）；HER-2過(guò)表達(dá)型者占16.4%（116/709）；三陰型者占20.2%（143/709）。組織學(xué)分類中，非特殊型浸潤(rùn)性癌占86.3%（612/709），浸潤(rùn)性小葉癌占3.4%（24/709），伴髓樣特征的癌占3.4%（24/709），黏液性癌占1.8%（13/709），其他特殊亞型浸潤(rùn)性癌占5.1%（36/709）。對(duì)612例非特殊型浸潤(rùn)性癌進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)者占7.0%（43/612），Ⅱ級(jí)者占 56.5%（346/612），Ⅲ級(jí)者占36.4%（223/612）。P53高表達(dá)者在Luminal A型乳腺癌中占6.1%（12/197），在HER-2陰性Luminal B型乳腺癌中占18.0%（34/189），在HER-2陽(yáng)性Luminal B型乳腺癌中占39.1%（25/64），在HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌中占50.0%（58/116），在三陰型乳腺癌中占42.7%（61/143），P53在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。P53在伴有髓樣特征的乳腺癌中表達(dá)率高于其他組織學(xué)類型（P＜0.05）。組織學(xué)分級(jí)越高，P53表達(dá)率越高（P＜0.05）。P53在不同年齡分組乳腺癌中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

Tab.2 Correlation of the expression of P53 with the clinicopathologic parameters of breast cancer表2 P53表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.3 P53表達(dá)與ER、PR、HER-2及Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析 P53在ER陰性組、PR陰性組、HER-2陽(yáng)性組及Ki-67高表達(dá)組中表達(dá)率較高（均P＜0.05）。相關(guān)性分析顯示，P53與ER、PR、HER-2及Ki-67在乳腺癌中的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.3 Correlation of the expression of P53 with ER,PR,HER-2 and Ki-67 of breast cancer表3 P53與ER、PR、HER-2及Ki-67表達(dá)的相關(guān)性例（%）

3 討論

P53基因位于人類染色體17p13.1，被喻為“基因組的守護(hù)者”，是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在DNA損傷或致癌信號(hào)傳導(dǎo)后穩(wěn)定于細(xì)胞核內(nèi)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)等，防止癌癥的發(fā)生發(fā)展［5］。P53基因分為野生型和突變型兩種，當(dāng)P53發(fā)生突變后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄下游靶基因，導(dǎo)致其功能改變或喪失，產(chǎn)生致癌基因的功能，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6］。采用免疫組化法檢測(cè)的P53蛋白為突變型P53。

3.1 浸潤(rùn)性乳腺癌中P53表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性 已有研究表明，P53基因突變與浸潤(rùn)性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān)［7］；表達(dá)P53蛋白的浸潤(rùn)性乳腺癌具有較強(qiáng)的增殖活性，患者易發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移［8］。我們對(duì)709例浸潤(rùn)性乳腺癌進(jìn)行了P53蛋白表達(dá)分析，P53高表達(dá)者占26.8%。在Luminal A型、HER-2陰性Luminal B型、HER-2陽(yáng)性Luminal B型、HER-2過(guò)表達(dá)型及三陰型浸潤(rùn)性乳腺癌中的高表達(dá)率分別為6.1%、18.0%、39.1%、50.0%、42.7%，P53蛋白的高表達(dá)多見(jiàn)于增殖活性高、侵襲性強(qiáng)的HER-2過(guò)表達(dá)型及三陰型乳腺癌中，P53的表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌分子分型密切相關(guān)。P53的表達(dá)還與乳腺癌的組織學(xué)類型與組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，即伴有髓樣特征的癌P53表達(dá)率較高，黏液性癌表達(dá)率最低；分級(jí)高（Ⅲ級(jí)）的非特殊類型浸潤(rùn)性癌P53表達(dá)率高，而分級(jí)低（Ⅰ級(jí)）者表達(dá)率低，這些結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道一致［9］，說(shuō)明P53蛋白表達(dá)在浸潤(rùn)性乳腺癌發(fā)展、侵襲過(guò)程中扮演了重要角色，是浸潤(rùn)性乳腺癌預(yù)后不良的參考指標(biāo)［10］。本研究還發(fā)現(xiàn)，P53的表達(dá)與ER、PR、HER-2及Ki-67表達(dá)有相關(guān)，提示P53基因在浸潤(rùn)性乳腺癌的發(fā)生機(jī)制方面可能發(fā)揮了重要作用，值得進(jìn)一步研究。

3.2 P53與乳腺癌治療新進(jìn)展 近年來(lái)，有關(guān)P53基因在浸潤(rùn)性乳腺癌臨床用藥方面的研究也取得了可喜的進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)性乳腺癌常用的化療藥物蒽環(huán)類藥物的敏感性及耐藥性與P53基因突變有關(guān)。對(duì)P53信號(hào)通路的干擾可能是蒽環(huán)類藥物化療耐藥的關(guān)鍵因素［11］。P53基因突變與蒽環(huán)類藥物新輔助化療治療方案的療效密切相關(guān)［12］。P53作為靶點(diǎn)的靶向藥物，例如小分子復(fù)合物YK-3-237［13］、P53 活化劑 NSC146109［14］、新 型 抗 HDM2（human double minute 2）靶向劑Nutlin-3a［15］等，均已取得了階段性研究成果，部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，或許將來(lái)能對(duì)三陰型乳腺癌的治療帶來(lái)新的希望［16］。

綜上所述，P53蛋白高表達(dá)多見(jiàn)于高增殖活性及高侵襲性的浸潤(rùn)性乳腺癌中，并與乳腺癌的組織學(xué)分型及分級(jí)密切相關(guān)。P53表達(dá)參與了浸潤(rùn)性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，并可作為臨床判斷預(yù)后和選擇化療藥物的參考指標(biāo)。靶向P53有望成為浸潤(rùn)性乳腺癌治療的新途徑。