王希輝，于向洋，喻文立△，杜洪印

肝移植術(shù)是終末期肝病最有效的治療方案［1］。然而，小兒肝移植術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生率高達(dá)46%，且與成人相比有更高的病死率［2-4］。小兒肝移植甚至可誘發(fā)遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙［5-6］。肝臟缺血再灌注（HIR）是肝移植過程中不可避免的病理生理過程，涉及血管活性因子、自由基和促炎性細(xì)胞因子的釋放，不僅可造成肝損害，還可影響遠(yuǎn)隔臟器的功能［7-8］。最近證據(jù)表明，HIR可損傷成年小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和認(rèn)知功能障礙［7,9-10］，但機制尚不清楚。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體是廣泛存在于腦的興奮性谷氨酸受體，與學(xué)習(xí)記憶能力關(guān)系密切，其介導(dǎo)的興奮性毒性是腦損傷的關(guān)鍵機制之一［11-12］。NMDA受體2A亞基（NR2A）酪氨酸磷酸化可上調(diào)NMDA受體活性，導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流及鈣超載，介導(dǎo)興奮性毒性［13］。本研究擬評價HIR對幼鼠海馬以及遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響，探討NR2A磷酸化在其中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康C57小鼠54只，2周齡，體質(zhì)量6～9 g，無特定病原體（SPF）級，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，環(huán)境溫度23～24℃，自由進(jìn)食、飲水。采用隨機數(shù)字表法分為3組（n=18）：假手術(shù)組（S）、HIR組（I）和NR2A抑制劑NVP-AAM077預(yù)處理組（N）。

1.2 試劑與儀器 兔源cleaved caspase-3一抗、兔源NR2A一抗（1∶1 000，Abcam，美國）；兔源p-NR2A Y1325、β-actin一抗（1∶1 000，Cell Signaling Technology，美國）；NVPAAM077（PEAQX,Med-ChemExpress，美國）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（中杉金橋，北京）；血清S100β和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 HIR模型的制備 參考文獻(xiàn)［10］的方法建立模型。術(shù)前禁食6 h，不限制飲水。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，燈照保溫。皮膚消毒，取腹正中縱行切口，暴露肝門區(qū)，小心分離肝臟周圍血管及韌帶；采用血管夾夾閉肝左、中葉脈管（門脈、動脈與膽道）的共干以達(dá)到70%的肝臟缺血；確認(rèn)血流阻斷成功后，以濕紗布遮蓋腹壁切口，缺血60 min時松開血管夾，沖洗腹腔后關(guān)腹。S組僅進(jìn)行開腹、游離第一肝門以及關(guān)腹等操作，不進(jìn)行脈管夾閉；N組于術(shù)后連續(xù)3 d每天予NVP-AAM077（10 mg/kg）腹腔注射；S組和I組以相同方式腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 標(biāo)本采集 再灌注3 d后，每組取5只小鼠同上述方式麻醉，迅速開胸，經(jīng)左心室采血0.5 mL，離心取血清；經(jīng)心臟由主動脈灌注預(yù)冷的肝素化生理鹽水20 mL沖洗，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中保存；另取5只小鼠，以相同方式斷頭取腦，剝離海馬組織，置于-80℃保存。

1.5 ELISA檢測血清S100β和NSE水平 使用商業(yè)化ELISA試劑盒檢測血清腦損傷標(biāo)志物S100β和NSE水平，具體實驗步驟參照試劑盒說明書。

1.6 HE染色觀察海馬組織病理形態(tài)腦組織石蠟包埋，制備4 μm病理切片，二甲苯脫蠟，先后經(jīng)蘇木紫、伊紅染色后于光鏡下觀察海馬組織病理形態(tài)。

1.7 Western blot檢測海馬組織蛋白表達(dá)水平 取海馬組織，稱質(zhì)量、研磨、裂解、離心、提上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠變性電泳（SDS-PAGE）后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以β-actin為內(nèi)參，分別用cleaved caspase-3、NR2A、p-NR2A Y1325特異性一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。經(jīng)KODAK IS440自顯影系統(tǒng)曝光顯影，使用Image J軟件處理數(shù)據(jù)，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值反映各蛋白的表達(dá)水平。

1.8 Morris水迷宮檢測小鼠認(rèn)知功能 每組取8只小鼠同上述造模后繼續(xù)飼養(yǎng)30 d，然后參照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行水迷宮測試。該裝置為直徑120 cm，高50 cm的圓形水池。根據(jù)直角坐標(biāo)，水池被等分為4個象限，在任一象限中心放一直徑9 cm的透明圓形平臺，平臺頂部低于水面1 cm，并保持平臺位置不變。于HIR手術(shù)30 d后進(jìn)行水迷宮實驗。（1）定位航行實驗：實驗歷時5 d，將小鼠分別從池壁4個象限的中點頭朝池壁放入水中，記錄小鼠找到并爬上平臺的時間（逃逸潛伏期）和平均游泳速度，規(guī)定每次訓(xùn)練的時間為60 s，如果小鼠在規(guī)定的60 s找不到平臺，須將其引導(dǎo)至平臺上，讓其學(xué)習(xí)10 s（此時潛伏期記為60 s）。（2）空間探索試驗：于水迷宮實驗第6天，撤去水下平臺，小鼠自由游泳60 s并記錄平臺所在象限滯留時間。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清S100β、NSE水平比較 與S組比較，I組和N組血清S100β、NSE水平升高（P＜0.05）；與I組比較，N組血清S100β、NSE水平降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the serum concentrations of S100β,NSE and the expression levels of cleaved caspase-3,NR2A and p-NR2A between the three groups表1 各組小鼠血清S100β、NSE水平，海馬組織Cleaved Caspase-3、NR2A、p-NR2A表達(dá)水平的比較（n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與S組比較，b與I組比較，P＜0.05

S100β（ng/L）1.02±0.28 2.67±0.33a 1.83±0.30ab 36.821＊＊組別S組I組N組F NSE（ng/L）12.24±3.23 33.52±2.81a 21.51±3.43ab 56.740＊＊Cleaved Caspase-3 0.20±0.03 0.52±0.05a 0.32±0.03ab 91.163＊＊NR2A 0.34±0.03 0.38±0.04 0.35±0.03 1.912 p-NR2A 0.16±0.03 0.37±0.04a 0.27±0.04ab 40.366＊＊

2.2 海馬組織病理形態(tài) 光鏡下，S組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；I組海馬組織明顯水腫，細(xì)胞排列紊亂；N組海馬病理變化情況較I組明顯改善，但未達(dá)到S組水平，見圖1。

2.3 海馬組織cleaved caspase-3、NR2A、p-NR2A表達(dá)水平 與S組比較，I組與N組cleaved caspase-3、p-NR2A水平明顯增加（P＜0.05）；與I組比較，NVPAAM077顯著降低了cleaved caspase-3、p-NR2A水平（P＜0.05）。3組之間NR2A表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1，圖2。

2.4 小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能 定位航行實驗中逃逸潛伏期3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？臻g探索實驗中，與S組比較，I組與N組平臺所在象限滯留時間縮短，與I組比較，N組平臺所在象限滯留時間延長（均P＜0.05），見表2。

Fig.1 The pathological morphology in the hippocampal CA1 region for the three groups(HE staining，×400)圖1 各組小鼠海馬組織CA1區(qū)病理形態(tài)（HE染色，×400）

Fig.2 Comparison of the expression levels of cleaved caspase-3,NR2A and p-NR2A between the three groups圖2 各組小鼠海馬組織Cleaved Caspase-3、NR2A、p-NR2A蛋白表達(dá)水平

3 討論

人類神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期是從妊娠末期6個月至出生后4歲，嚙齒類動物約在出生后4～5周內(nèi)［15］。在這個階段，神經(jīng)系統(tǒng)非常脆弱，極易受到外界刺激的傷害，甚至可能留下遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［16］。動物研究表明，HIR導(dǎo)致成年小鼠海馬組織病理改變和術(shù)后認(rèn)知功能障礙［7,9-10］。但是HIR是否可影響幼鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能尚未證實。本研究選擇2周齡C57小鼠，觀察HIR對幼鼠海馬神經(jīng)元和遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響，并探討相關(guān)機制。

S100β蛋白是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，腦損傷發(fā)生時，S100β從膠質(zhì)細(xì)胞透過血腦屏障進(jìn)入外周血液，導(dǎo)致血清濃度升高，是評判血腦屏障開放以及膠質(zhì)細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)［17-18］。NSE特異地存在于神經(jīng)元胞漿中，可在腦損傷時穿過受損的血腦屏障導(dǎo)致血清濃度升高，是評價神經(jīng)元損傷的常用標(biāo)志物［18-19］。本研究結(jié)果顯示，I組血清S100β與NSE濃度較S組升高，海馬組織明顯水腫，細(xì)胞排列紊亂，說明HIR可誘導(dǎo)腦損傷，與以往研究［7,10］得出了相似的結(jié)論。

Tab.2 Comparison of the escape latency and the time spent in the target quadrant in the Morris water maze test between the three groups表2 各組小鼠水迷宮實驗逃逸潛伏期與平臺所在象限滯留時間的比較 （n=8，±s）

Tab.2 Comparison of the escape latency and the time spent in the target quadrant in the Morris water maze test between the three groups表2 各組小鼠水迷宮實驗逃逸潛伏期與平臺所在象限滯留時間的比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與S組比較，b與I組比較，P＜0.05

第2天29.3±20.1 32.3±19.0 28.2±14.9 0.110組別S組I組N組F逃逸潛伏期（s）第1天45.2±17.5 51.0±16.3 46.2±22.1 0.218第3天26.5±14.7 31.0±17.6 28.8±8.5 0.203第4天16.7±11.4 17.2±16.6 19.1±12.0 0.070第5天11.2±6.4 18.9±17.0 16.2±12.8 0.742平臺所在象限滯留時間（s）36.5±5.6 17.6±4.3a 26.8±3.7ab 33.739＊＊

NMDA受體是具有離子通道特性的谷氨酸受體，NMDA受體亞基NR2A的酪氨酸磷酸化可上調(diào)NMDA受體活性，導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流及鈣超載，介導(dǎo)興奮性毒性［11］。研究表明NR2A的酪氨酸磷酸化與腦缺血［20］、抑郁［21］、癲癇［22］、腦出血［23］等多種病理模型關(guān)系密切，而NR2A是否參與HIR后海馬損傷尚無研究證實。NR2A Y1325磷酸化位點是主要的酪氨酸殘基之一，其磷酸化水平被認(rèn)為是反映NMDA受體活性的良好指標(biāo)［24］。本研究結(jié)果顯示，與S組比較，I組NR2A Y1325的磷酸化水平上調(diào)，但NR2A總蛋白水平未見改變，提示HIR并不影響NR2A的表達(dá)，而是通過上調(diào)NR2A磷酸化水平提高NMDA受體活性；NVP-AAM077后處理不僅降低了HIR后NR2A的磷酸化水平，而且抑制了凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)，并且降低了血清S100β、NSE濃度，緩解了腦損傷。因此，筆者推斷海馬神經(jīng)元NR2A Y1325過度磷酸化通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑參與HIR后海馬損傷。

Morris水迷宮是用于鼠類空間學(xué)習(xí)記憶研究的裝置，廣泛應(yīng)用于動物行為學(xué)實驗研究［7,14］。應(yīng)用HIR 30 d小鼠進(jìn)行遠(yuǎn)期認(rèn)知功能評價是本研究的創(chuàng)新之處，選擇HIR30 d小鼠進(jìn)行水迷宮實驗出于兩方面的考慮，一方面HIR 30 d小鼠相當(dāng)于青春期末期，此時小鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能趨于穩(wěn)定，可有效反映HIR對小鼠認(rèn)知的長期影響；另一方面只有大于6周齡的小鼠才有足夠體力完成水迷宮實驗。研究結(jié)果表明HIR可損害小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能，NVPAAM077后處理明顯改善了小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能。基于以上研究，推斷幼鼠HIR可引起腦損傷和遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙，且NR2A Y1325過度磷酸化與HIR后腦損傷及遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切。

綜上所述，幼鼠HIR可導(dǎo)致腦損傷和遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙，其機制可能與NR2A Y1325過度磷酸化介導(dǎo)的興奮性毒性和細(xì)胞凋亡有關(guān)。