陳建梅，楊蕊蕊，劉洪恩，劉洪欣，史文新，劉姣，4△

Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程中起重要作用［1］。在STAT家族的7個成員中，對STAT3的研究最為明確。細(xì)胞質(zhì)中的STAT3被JAK2激活后，進(jìn)入細(xì)胞核，可通過對相關(guān)基因的直接和間接調(diào)控作用促進(jìn)血管新生，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化或凋亡［2］。目前，關(guān)于JAK2/STAT3與腫瘤的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMS）是育齡期婦女的常見疾病，近年來發(fā)病率逐年增高。EMS的發(fā)病機(jī)制至今不明，但其血管新生、細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)特性與腫瘤相似［3-4］。EMS異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等可能與STAT3信號通路有關(guān)。本研究應(yīng)用JAK2的特異性磷酸化抑制劑AG490干預(yù)JAK2/STAT3的激活，觀察大鼠EMS異位內(nèi)膜的生長情況，明確JAK2/STAT3信號通路是否參與EMS的發(fā)病過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar大鼠，清潔級，雌性，體質(zhì)量180～200 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SYXK（冀）2016-0047。飼養(yǎng)于溫度20～23℃，濕度45%～60%，過氧乙酸溶液消毒環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料和水喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 AG490（JAK2/STAT3通路阻斷劑，批號：T3434，Santa Cruz Biotechnology，Inc.），孕三烯酮膠囊（2.5 mg，批號：53140701，華潤紫竹藥業(yè)有限公司），硫酸慶大霉素注射液（2 mL，8萬單位，批號：1607201，山東華魯制藥有限 公 司），雌二醇片（2 mg，批 號 ：340436，Solvay Pharmaceuticals B.V.，雌二醇磨去糖衣后碾碎，用1%羧甲基纖維素鈉溶液溶解），兔抗人JAK2（phospho Y1007+Y1008）多克隆抗體（ab32101，Abcam Ltd），兔抗人JAK2多克隆抗體（ab39636，Abcam Ltd），小鼠抗人STAT3（phospho Y705）單克隆抗體（SC-8059，Santa Cruz Biotechnology，Inc.），兔抗人STAT3單克隆抗體（ab68153，Abcam Ltd），兔抗小鼠GAPDH單克隆抗體（ab181602，Abcam Ltd），HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG二抗（ab6728，Abcam Ltd），HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG 二抗（ab97051，Abcam Ltd）。電泳儀及電泳槽（北京六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD PACIFIC Limited）。

1.2 方法

1.2.1 造模 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg體質(zhì)量），麻醉后，剖開腹部找到子宮，將右側(cè)子宮周圍組織分離，用手術(shù)線將子宮的兩頭結(jié)扎，兩結(jié)扎處之間相距大約1 cm，剪取。把切取的子宮內(nèi)膜豎向剪開，在左側(cè)腹部的腹壁上內(nèi)膜向里用縫合針和手術(shù)線打結(jié)釘上，再縫合大鼠腹部。假手術(shù)組僅進(jìn)行右側(cè)子宮的結(jié)扎和剪取，不縫合于腹壁上，其余操作同上。手術(shù)后對每只大鼠進(jìn)行腹腔注射硫酸慶大霉素注射液，用藥量為0.4萬U/只，連續(xù)注射5 d。進(jìn)行手術(shù)的次日，為加快移植子宮內(nèi)膜的生長，對每只大鼠灌胃雌二醇，假手術(shù)組則灌胃等量1%羧甲基纖維素鈉溶液，用藥量為10 mL/kg體質(zhì)量，每5 d 1次，共3次。末次灌胃雌二醇4 d后，再次麻醉大鼠，開腹后觀察子宮內(nèi)膜組織移植部位，若肉眼可見內(nèi)膜組織生長且內(nèi)有液體積聚的透明小囊，則為造模成功。

1.2.2 分組及給藥 將造模成功的40只大鼠按體質(zhì)量分為4個區(qū)組，然后將每個體質(zhì)量范圍內(nèi)的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分為2組，分別為模型組、JAK2/STAT3通路抑制劑組（AG組），每組20只，另設(shè)假手術(shù)組大鼠20只。AG組于造模前5 min腹腔注射AG490（1 mg/kg體質(zhì)量），手術(shù)后按4 mg/kg體質(zhì)量注射，每周2次，連續(xù)6周，模型組給予生理鹽水。

1.2.3 取材 末次給藥后禁食12 h，麻醉大鼠，剖開腹部，以游標(biāo)卡尺測量異位子宮內(nèi)膜的長徑（a）和短徑（b）后取材，假手術(shù)組剪取正常子宮組織，部分組織在10%福爾馬林溶液中固定，剩余組織于-80℃凍存。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 異位內(nèi)膜體積和生長抑制率 分別按照下列公式計(jì)算異位內(nèi)膜體積和生長抑制率。異位內(nèi)膜體積（V）=a×b2×0.52。抑制率=（模型組平均體積-AG組平均體積）/模型組平均體積×100%。

1.3.2 組織形態(tài)學(xué)分析 取異位子宮內(nèi)膜組織或正常子宮組織，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色（HE），光鏡觀察。

1.3.3 蛋白印跡法（Western blot）檢測組織中蛋白表達(dá) 取大約500 mg異位內(nèi)膜組織，加入1 mL裂解液勻漿，冰上靜置消除泡沫后，4℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液加入SDS Loading Buffer，沸水浴加熱5 min變性。蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳，每孔上樣等量總蛋白。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%BSA封閉2 h。隨后分別加入1∶2 000的p-JAK2、JAK2、P-STAT3和STAT3多克隆抗體，以GAPDH為內(nèi)參，4℃冰箱過夜。次日加入1∶2 000的HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，洗膜，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光檢測并記錄各目的條帶及內(nèi)參條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠異位內(nèi)膜體積的差異以及生長抑制率 模型組大鼠子宮內(nèi)膜移植物體積增大，呈半透明的囊狀，囊內(nèi)有液體積聚，表面有血管分布，盆腔有廣泛粘連；AG組大鼠子宮內(nèi)膜移植物體積較小，囊內(nèi)僅有少量液體或無液體，盆腔粘連輕微，見圖1。測量并計(jì)算各組大鼠異位內(nèi)膜體積，模型組為（155.69±137.57）mm3，AG組為（53.46±49.96）mm3，較模型組體積顯著減小（t=2.210，P＜0.05），異位內(nèi)膜組織生長的抑制率為65.66%。

Fig.1 The appearance of rat endometrial graft圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜移植物外觀

2.2 各組大鼠異位內(nèi)膜組織病理形態(tài)學(xué)差異 假手術(shù)組子宮內(nèi)膜被覆單層柱狀上皮，排列整齊，肌層較厚；模型組異位子宮內(nèi)膜被覆上皮細(xì)胞呈扁平狀，腔體內(nèi)有中性粒細(xì)胞聚集，血管較為豐富；AG組大鼠異位內(nèi)膜表現(xiàn)出不同程度的變薄萎縮，上皮細(xì)胞缺失，見圖2。

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中JAK2、STAT3磷酸化水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠異位內(nèi)膜組織中JAK2、STAT3總蛋白及其磷酸化水平（p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3）均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，AG組大鼠異位內(nèi)膜組織中STAT3總蛋白及其磷酸化水平均明顯降低（P＜0.05），AG組大鼠異位內(nèi)膜組織中JAK2磷酸化水平較模型組明顯降低，但其總蛋白表達(dá)與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1，圖3。

Fig.2 Pictures showing pathological morphology of ectopic endometrium in three groups（HE staining，×100）圖2 各組大鼠異位內(nèi)膜組織的病理形態(tài)（HE染色，×100）

Tab.1 The protein expressions of p-JAK2,JAK2,p-STAT3 and STAT3 in the endometrium tissues of rats表1 各組大鼠內(nèi)膜組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的蛋白表達(dá) （n=3，±s）

Tab.1 The protein expressions of p-JAK2,JAK2,p-STAT3 and STAT3 in the endometrium tissues of rats表1 各組大鼠內(nèi)膜組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的蛋白表達(dá) （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05

p-JAK2 0.25±0.02 0.63±0.03a 0.31±0.01ab 199.89＊＊組別假手術(shù)組模型組AG組F JAK2 0.42±0.07 0.65±0.05a 0.57±0.01a 17.43＊＊p-JAK2/JAK2 0.61±0.13 0.97±0.12a 0.55±0.03b 14.55＊＊p-STAT3 0.11±0.01 0.66±0.07a 0.33±0.02ab 131.90＊＊STAT3 0.52±0.01 0.86±0.07a 0.70±0.01ab 46.02＊＊p-STAT3/STAT3 0.21±0.01 0.77±0.02a 0.47±0.02ab 774.99＊＊

3 討論

EMS是一種常見的婦科疾病，在育齡期婦女中多發(fā)。由本病引起的盆腔痛、痛經(jīng)、不孕等問題，給患者的工作和生活帶來極大的困擾。EMS雖為良性疾病，卻具有遷移、侵襲、種植、復(fù)發(fā)等類似于腫瘤的惡性生物學(xué)特征［3-4］。多年來，國內(nèi)外學(xué)者一直在努力探索EMS的發(fā)病機(jī)制，以利于這一疾病的治療。1921年Sampson提出的“經(jīng)血逆流”學(xué)說，被作為經(jīng)典理論，該學(xué)說認(rèn)為脫落的子宮內(nèi)膜碎片流入腹腔，種植在盆腔臟器表層，并在雌、孕激素的作用下不斷發(fā)展形成病灶［5］。而子宮內(nèi)膜能否在“異域”生長以至發(fā)病，要經(jīng)過黏附、侵襲和血管形成三個復(fù)雜的病理生理過程，涉及到細(xì)胞黏附因子、侵襲因子、血管生成因子，并與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)［6-7］。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游基因的表達(dá)，形成與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移、侵襲等生物學(xué)行為相關(guān)基因啟閉的“總閥門”。如果找到某些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)，就可以阻斷下游基因，引發(fā)“級聯(lián)式”阻斷，抑制多種基因表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到抗異位內(nèi)膜細(xì)胞生長的目的。

JAK/STAT信號通路，與細(xì)胞分化、增殖、侵襲、凋亡抵抗和免疫抑制均密切相關(guān)［1-2］。STAT3是STAT家族的重要成員，受JAK2的作用，形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。病理狀態(tài)下，大量干擾素、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、生長因子等與細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合，可引起細(xì)胞內(nèi)JAK2的聚集、相互作用，并發(fā)生磷酸化。活化后的JAK2與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的STAT3結(jié)合，引起STAT3磷酸化［8］。STAT3被激活后，進(jìn)入核內(nèi)，直接或間接調(diào)控相關(guān)基因誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化，形成新生血管。

Fig.3 The protein expressions of p-JAK2,JAK2,p-STAT3 and STAT3 in the endometrium tissues of rats圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的蛋白表達(dá)

為證實(shí)JAK2/STAT3信號通路在EMS發(fā)展過程中的作用，本研究采用自體移植法復(fù)制大鼠EMS模型，檢測JAK2和STAT3總蛋白及其磷酸化水平，結(jié)果表明異位病灶部位JAK2和STAT3總蛋白及其磷酸化水平明顯高于正常子宮組織。有研究證實(shí)，激活后的STAT3能以二聚體的形式持續(xù)進(jìn)入核內(nèi)，對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等下游靶基因進(jìn)行調(diào)控，導(dǎo)致其高表達(dá)［9-10］。VEGF能促使血管異常增生，MMPs也可在新血管生成的初期加強(qiáng)原有血管的重構(gòu)，Bcl-2使細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)［11-12］。三者的高表達(dá)促進(jìn)了局部病灶血管的生成和細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，有利于EMS的發(fā)生［10］。本研究以AG490干預(yù)后，通過對這一通路的抑制，JAK2和STAT3的磷酸化水平顯著降低，模型大鼠表現(xiàn)出異位病灶體積明顯減小，病理改變情況減輕。因此推測，JAK2/STAT3信號通路在EMS的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，而抑制JAK2/STAT3信號通路則能夠?qū)MS的治療產(chǎn)生積極作用，本研究為探討EMS的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為EMS的治療用藥研發(fā)提供了新的思路。