陳明輝，田娟

鐵是腦組織必需的微量元素之一，分布于腦內(nèi)某些神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)，參與多種生理活動［1］。鐵超載可產(chǎn)生大量羥自由基，對細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷乃至死亡［2］。目前，大腦鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控機制尚不明確。Ndfip1（Nedd4 family interacting protein 1）蛋白是一種進(jìn)化保守的跨膜蛋白，參與多種蛋白的泛素化降解過程［3］。研究顯示Ndfip1參與調(diào)控鐵離子的穩(wěn)態(tài)平衡，但具體作用機制尚無定論［4］。本研究應(yīng)用Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，觀察鐵超載條件下Ndfip1對神經(jīng)細(xì)胞存活率和鐵代謝的影響，探討Ndfip1對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 SH-SY5Y細(xì)胞購于南京科佰生物公司。Ndfip1質(zhì)粒由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。兔抗Ndfip1抗體購于美國Sigma公司。小鼠GAPDH單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（鼠）IgG二抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。PVDF膜和蛋白marker購于美國NEB公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存細(xì)胞，放入37℃水浴震蕩快速融化；將細(xì)胞懸液吸出置于EP管，并與1 mL的DMEM均勻混合；1 000 r/min離心5 min，去除上清；吸取1 mL DMEM加入EP管，輕柔吸吹，重懸細(xì)胞；吸取細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶，輕柔搖勻，放入37℃、5%CO2，100%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)；按時觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，及時置換培養(yǎng)液；細(xì)胞密度達(dá)到80%傳代培養(yǎng)。

1.2.2 鐵超載濃度測定 將細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL并接種于96孔板；當(dāng)細(xì)胞貼壁，將培養(yǎng)液置換成無血清、無抗生素培養(yǎng)液；加入不同濃度（0、10、50、100、200、500 μmol/L）的FeSO4繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集各組細(xì)胞，每孔加入200 μL MTT，放入37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h；倒掉培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，在37℃條件下反應(yīng)10 min；將96孔板放置酶標(biāo)儀內(nèi)，測定每孔OD值（波長595 nm），計算細(xì)胞存活率，確定實驗最佳的鐵超載濃度。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/mL，加入12孔板；當(dāng)細(xì)胞貼壁后，替換無血清、無抗生素培養(yǎng)液；細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)達(dá)70%～80%融合；取1.5 μL LipofectamineTM2000，用無血清、無抗生素培養(yǎng)液稀釋至75 μL，混勻，室溫靜止5 min；取0.6 μg Ndfip1質(zhì)粒（實驗組）或空質(zhì)粒（對照組），用無血清、無抗生素培養(yǎng)液稀釋至75 μL，混勻，室溫靜置5 min；將稀釋好的LipofectamineTM2000和Ndfip1質(zhì)粒（或空質(zhì)粒）混勻，室溫靜置30 min；將混合液加入12孔板培養(yǎng)細(xì)胞的無血清、無抗生素培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h；將培養(yǎng)液置換為常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率 將細(xì)胞制成懸液，將細(xì)胞密度調(diào)至1×105/mL并接種于96孔板；當(dāng)細(xì)胞貼壁，將培養(yǎng)液置換成無血清、無抗生素培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)；各組處理達(dá)預(yù)定作用時間后，參照1.2.2的步驟計算細(xì)胞存活率。

1.2.5 蛋白印跡檢測Ndfip1蛋白表達(dá)量 2組細(xì)胞經(jīng)4℃PBS沖洗3次，移至離心管，1 000 r/min低溫離心5 min，棄上清后，加入蛋白裂解液4℃裂解1.5 h，12 000 r/min低溫離心30 min，考馬斯亮藍(lán)法對上清液進(jìn)行蛋白定量。取50 μg待檢測蛋白，加十二烷基磺酸鈉上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（1∶200）4℃震蕩孵育過夜，PBS漂洗3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2 000）室溫震蕩孵育2 h，PBS漂洗3次，應(yīng)用HRP-ECL蛋白檢測發(fā)光，在凝膠電泳圖像分析儀中收集圖像。

1.2.6 Calcein AM法檢測鐵離子 Calcein（鈣黃綠素）可以與鐵結(jié)合使其轉(zhuǎn)換成非熒光物質(zhì)而使其熒光熄滅，鈣黃綠素的熒光強度與細(xì)胞內(nèi)鐵的含量成反比，熒光弱說明細(xì)胞內(nèi)含鐵量多，提示鐵在不斷的轉(zhuǎn)入；熒光強說明細(xì)胞內(nèi)含鐵量少，提示鐵轉(zhuǎn)入減少。將細(xì)胞制成懸液，將細(xì)胞密度調(diào)至1×105/mL后將接種于6孔板；Ndfip1質(zhì)粒（或空質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞48 h；倒掉培養(yǎng)液，加入含0.5 μmol/L Calcein AM的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)30 min。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量 細(xì)胞經(jīng)過Calcein AM法處理后，棄去培養(yǎng)液，PBS充分漂洗，加入200 μmol/L FeSO4溶液作用10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.2.8 熒光分光光度計檢測細(xì)胞攝入鐵的變化 細(xì)胞經(jīng)過Calcein AM法處理后，棄去培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化，PBS充分沖洗，1 000 r/min離心5 min，1 mL PBS懸浮細(xì)胞，取500 μL細(xì)胞懸液加入比色杯，熒光分光光度計記錄基礎(chǔ)熒光強度，加入FeSO4溶液（終濃度20 μmo/L），熒光分光光度計持續(xù)記錄熒光強度（1 800 s），激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長515 nm。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FeSO4對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 分別用0、10、50、100、200、500 μmol/L FeSO4處理SH-SY5Y細(xì)胞，隨著FeSO4濃度增加，SH-SY5Y細(xì)胞存活率逐漸降低。其中，200 μmol/L FeSO4作用下SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.375，P＜ 0.05），見圖1。確定后續(xù)實驗鐵超載濃度為200 μmol/L。

Fig.1 Changes of survival rates of SH-SY5Y cells under different concentrations of FeSO4圖1 不同濃度FeSO4作用下SH-SY5Y細(xì)胞存活率變化

2.2 Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的測定 Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞48 h后檢測細(xì)胞內(nèi)Ndfip1蛋白表達(dá)量，以確定Ndfip1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。蛋白印跡結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組Ndfip1蛋白相對灰度值為0.676±0.021；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Ndfip1蛋白相對灰度值為0.987±0.017，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.305，P＜0.01），見圖2。

2.3 Ndfip1過表達(dá)對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果顯示，在200 μmol/L FeSO4作用下，實驗組細(xì)胞存活率（71.5%±3.1%）明顯高于對照組（62.8%±3.7%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.427，P＜0.05）。

Fig.2 The transfection efficiency of Ndfip1 plasmid圖2 Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

2.4 Ndfip1過表達(dá)對SH-SY5Y細(xì)胞鐵離子含量的影響 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞內(nèi)熒光較弱，實驗組細(xì)胞內(nèi)熒光較強，提示Ndfip1過表達(dá)可減少細(xì)胞內(nèi)鐵離子的含量，見圖3。

Fig.3 The fluorescent intensity of two groups of cells(×200)圖3 2組細(xì)胞的熒光強度（×200）

2.5 Ndfip1過表達(dá)對SH-SY5Y細(xì)胞鐵攝入能力的影響 結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞內(nèi)熒光淬滅的速度較快，而實驗組細(xì)胞內(nèi)熒光淬滅的速度減慢，提示實驗組細(xì)胞鐵離子的攝入減少，見圖4。

3 討論

3.1 鐵超載對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用 研究顯示，鐵離子超載對細(xì)胞可造成損傷［2］。為驗證其對神經(jīng)細(xì)胞是否適用，本研究分別檢測了0、10、50、100、200、500 μmol/L濃度FeSO4作用下SH-SY5Y細(xì)胞存活率的變化。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著FeSO4濃度不斷增加，SHSY5Y細(xì)胞存活率逐漸降低。其中200 μmol/L FeSO4可使細(xì)胞存活率明顯下降，說明鐵超載對神經(jīng)細(xì)胞亦存在損傷作用。我們的實驗結(jié)果與前人的報道基本一致［5］。

Fig.4 Changes of fluorescence intensity in two groups of cells圖4 2組細(xì)胞熒光強度的變化

3.2 Ndfip1對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用 進(jìn)一步實驗證實，Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，SH-SY5Y細(xì)胞存活率提高，即Ndfip1蛋白過表達(dá)可減少鐵超載對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用。換言之，Ndfip1蛋白對神經(jīng)細(xì)胞可能具有一定的保護(hù)作用或抗凋亡作用。另有文獻(xiàn)報道，應(yīng)用不同濃度的CoCl2或FeCl2分別作用于SHSY5Y細(xì)胞和人原代培養(yǎng)皮質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著金屬離子濃度的增加，Ndfip1表達(dá)上調(diào)［6］。由此推測Ndfip1可保護(hù)神經(jīng)元對抗金屬離子的毒性作用。

3.3 Ndfip1的保護(hù)作用機制 為明確Ndfip1對神經(jīng)元的保護(hù)作用機制，我們檢測了Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量的變化及鐵攝入能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ndfip1過表達(dá)可減少神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鐵離子的含量；同時也證實了Ndfip1過表達(dá)可減少神經(jīng)細(xì)胞鐵離子的攝入，減少了鐵離子在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，減輕鐵超載對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，從而提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率，發(fā)揮其保護(hù)作用。但Ndfip1通過何種機制影響鐵的轉(zhuǎn)入尚不清楚。二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）是體內(nèi)唯一的鐵轉(zhuǎn)入蛋白。文獻(xiàn)報道顯示，Ndfip1與DMT1存在相關(guān)性［7］。Foot等［8-9］研 究 發(fā) 現(xiàn) Ndfip1 對DMT1轉(zhuǎn)運能力具有一定的調(diào)控作用。在Ndfip1基因敲除小鼠的肝門靜脈周圍有明顯鐵沉積；在原代培養(yǎng)的Ndfip1-/-小鼠肝細(xì)胞內(nèi)DMT1轉(zhuǎn)運活性增加；飼以低鐵飲食的Ndfip1-/-小鼠十二指腸上皮細(xì)胞DMT1轉(zhuǎn)運活性增加，表明Ndfip1基因沉默可增強DMT1的轉(zhuǎn)運活性。Howitt等［10］研究發(fā)現(xiàn)Ndfip1能下調(diào)DMT1的表達(dá)。另有在體實驗證實Ndfip1-/-小鼠肝、十二指腸上皮細(xì)胞以及大腦神經(jīng)元DMT1表達(dá)增加［11］。由此推測，Ndfip1在鐵代謝過程中可能具有重要的調(diào)控作用。今后，本課題組將進(jìn)一步關(guān)注腦內(nèi)Ndfip1與鐵調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（如DMT1等）的關(guān)系，深入揭示Ndfip1參與腦鐵代謝的機制，為鐵代謝紊亂相關(guān)疾病的診斷、治療和預(yù)防提供理論依據(jù)。