李玉琴，施建平，金怒云，步麗梅，王凱，田培營

結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床上常見的消化道惡性腫瘤之一，全球每年發(fā)病例數(shù)超過100萬，且大多數(shù)CRC患者確診時已發(fā)展到疾病中晚期，即使進行手術(shù)和放化療，遠期生存率仍不樂觀［1］，所以從細胞分子生物學(xué)角度尋找抑制結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的方法具有一定臨床意義。環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是前列腺素E2合成的限速酶，通過介導(dǎo)磷酸肌醇3激酶/磷脂酰肌醇依賴性激酶1/蛋白激酶 B（phosphoinositide-3 kinase/phosphoinositide-dependent kinase 1/protein kinase B，PI3K/PDK1/AKT）信號通路，從而促進結(jié)腸癌發(fā)生，被視作潛在的治療靶點［2］。新化合物OSU-03012是COX-2抑制劑Celecoxib的衍生物。研究顯示，OSU-03012可在不損傷正常組織的情況下殺滅腫瘤細胞［3］。本研究擬從體外研究OSU-03012對結(jié)腸癌細胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其分子機制，從而為拓展OSU-03012的抗腫瘤治療譜和研發(fā)結(jié)腸癌新的治療策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人結(jié)腸癌細胞株HCT-116購自中國科學(xué)院上海細胞庫；DMEM/F-12培養(yǎng)液、胎牛血清購自GBICO公司；Annexin V-FITC試劑盒、Trizol試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司；鼠源B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購自美國Abcam公司；CCK-8試劑盒、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記山羊抗小鼠IgG、花青素（cyanidin3，Cy3）標記山羊抗小鼠IgG等二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組 人結(jié)腸癌細胞株HCT-116以含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至70%～80%時，換不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。分別用1、3、5和10 μmol/L OSU-03012干預(yù)（分別命名為1 μmol/L組、3 μmol/L組、5 μmol/L組和10 μmol/L組），以等體積二甲基亞砜（DMSO）處理的細胞作為對照組。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖情況 HCT-116細胞用胰酶消化后離心，用完全培養(yǎng)基重懸，接入96孔板中，共4塊，每塊板鋪3×5個孔，5 000個細胞/孔。按1.2.1分組以對應(yīng)的藥物濃度加藥，200 μL/孔，對照組加入等體積的DMSO，放入含5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、24、48、72 h；到達預(yù)定的時間后，每孔加入20 μL CCK-8溶液；37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h；測定450 nm處光密度（OD）值，計算抑制率。抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值。

1.2.3 劃痕實驗 Marker筆在6孔板背后用直尺均勻地劃橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線；在孔中加入約8×105個細胞，接種原則為過夜后融合率達到100%；次日用200 μL槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭垂直，不能傾斜（不同孔之間最好用同一槍頭）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)液；對照組加入等體積DMSO、其余處理組以不同濃度的OSU-03012干預(yù)；放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，0、24、48、72及 96 h時間點取樣拍照。

1.2.4 Transwell實驗 取生長狀態(tài)良好的HCT-116細胞，采用不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞12 h，使細胞處于饑餓狀態(tài)，收集細胞，調(diào)整細胞濃度至2×105個/mL。Transwell上室中加入150 μL細胞懸液，下室中加入600 μL含不同濃度OSU-03012的培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，用棉簽將小室內(nèi)殘留細胞擦凈。固定10 min后，采用結(jié)晶紫染色20 min并封片。顯微鏡下（×200）觀察穿過濾膜的細胞，隨機讀取6個視野統(tǒng)計細胞數(shù)量。

1.2.5 細胞流式實驗 收集分組處理24 h后的細胞，PBS重懸細胞并計數(shù)，取（5～10）×104個細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞；加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻；室溫避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞；加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置；流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.6 熒光共聚焦實驗 將分組處理24 h后的細胞接種到預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細胞密度達到85%～90%后取出蓋玻片，PBS洗2次；多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；采用通透劑處理細胞5～15 min，通透后用PBS洗滌3次，每次5 min；使用封閉液封閉細胞30 min，加入一抗，室溫孵育1 h，采用加入Tween-20的PBS緩沖液（PBSTween-20，PBST）漂洗3次，每次5 min，加入二抗，室溫避光孵育1 h，PBST漂洗3次，每次5 min，蒸餾水漂洗1次；封片后，采用熒光顯微鏡（×200；封片）觀察并拍照。

1.2.7 Real-time PCR實驗檢測Caspase-3和Bcl-2mRNA表達情況 收集分組處理后的各組HCT-116細胞，采用Trizol試劑提取細胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBR GREEN定量PCR說明書步驟進行PCR擴增。實時熒光PCR擴增條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃ 34 s，共42個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。計算各組2-ΔΔCt值，內(nèi)參基因為GAPDH。各檢測基因引物序列見表1。

1.2.8 Western blot檢測Bcl-2和Caspase-3蛋白表達情況 收集分組處理后的各組HCT-16細胞，提取細胞總蛋白后，采用BCA法進行蛋白定量，制作SDS-PAGE凝膠，每孔加入蛋白樣品30 μg進行電泳，電泳完畢后轉(zhuǎn)膜，再在常溫下封閉2 h，加入一抗，低溫孵育過夜，膜洗凈后，加入二抗常溫孵育1 h，膜洗凈后，在暗室滴加顯影液顯影并拍照，采用Quantity one v4.6.6軟件分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab.1 Primer sequence of each gene表1 各基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 OSU-03012對HCT-116細胞增殖能力的影響 24、48及72 h時，除24 h 3 μmol/L組與1 μmol/L組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，抑制率均隨濃度增加呈逐漸增加趨勢（P＜0.05），見表2。

Tab.2 The inhibition rate of HCT-116 cells after treatment with OSU-03012表2 OSU-03012作用HCT-116細胞后抑制率（n=3，±s）

Tab.2 The inhibition rate of HCT-116 cells after treatment with OSU-03012表2 OSU-03012作用HCT-116細胞后抑制率（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；abc分別與1、3、5 μmol/L組比較，P＜0.05

組別1 μmol/L組3 μmol/L組5 μmol/L組10 μmol/L組F 24 h 0.05±0.03 0.09±0.04 0.32±0.02ab 0.43±0.02abc 121.061＊＊48 h 0.14±0.03 0.29±0.02a 0.38±0.06ab 0.72±0.04abc 111.554＊＊72 h 0.24±0.01 0.38±0.04a 0.56±0.07ab 0.83±0.04abc 94.866＊＊

2.2 OSU-03012對結(jié)腸癌細胞遷移能力的影響 不同時間點，各組細胞遷移情況見圖1，細胞遷移距離，對照組＞1 μmol/L組＞3 μmol/L組＞5 μmol/L組＞10 μmol/L組。Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，對照組、1 μmol/L組、3 μmol/L組、5 μmol/L組和10 μmol/L組細胞遷移數(shù)目分別為（62±10）個、（51±8）個、（45±6）個、（40±3）個和（23±6）個，呈逐漸降低趨勢（n=3，F(xiàn)=12.716，P＜0.05），見圖2。

2.3 OSU-03012對結(jié)腸癌細胞凋亡的影響 對照組、1 μmol/L組、3 μmol/L組、5 μmol/L組及10 μmol/L組凋亡率分別為（1.86±0.55）%、（3.08±0.33）%、（5.65±0.22）%、（11.20±0.20）%及（20.63±4.23）%，呈逐漸增加趨勢（n=3，F(xiàn)=48.120，P＜0.05），見圖3。

2.4 免疫熒光檢測OSU-03012對Bcl-2和Caspase-3表達的影響 1、3、5、10 μmol/L組Bcl-2蛋白表達弱于對照組，而Caspase-3蛋白表達強于對照組，見圖4、5。

2.5 OSU-03012對Bcl-2和Caspase-3表達的影響 3、5、10 μmol/L組Bcl-2 mRNA和蛋白表達量低于對照組，而Caspase-3 mRNA和蛋白表達量高于對照組（均P＜0.05），見表3、圖6。

Fig.1 The migration ability of HCT-116 cells detected by scratch test(×200)圖1 劃痕實驗檢測HCT-116細胞遷移能力（×200）

Fig.2 The migration ability of HCT-116 cells detected by Transwell test(crystal violet staining,×200)圖2 Transwell實驗檢測HCT-116細胞遷移能力（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig.3 Apoptosis rates of cells detected by cellular flow experiment圖3 細胞流式實驗檢測凋亡率

3 討論

Fig.4 The expression of Bcl-2 detected by immunofluorescence assay(×200)圖4 免疫熒光實驗檢測Bcl-2表達情況（×200）

Fig.5 The expression of Caspase-3 detected by immunofluorescence assay(×200)圖5 免疫熒光實驗檢測Caspase-3表達情況（×200）

COX-2在前列腺素合成中起關(guān)鍵作用，是前列腺素E2合成的限速酶。COX-2活性增加可促進前列腺素E2合成，進而抑制機體免疫功能，誘導(dǎo)血管生成，誘導(dǎo)K-ras、Bcl-2等促癌基因表達，抑制癌細胞凋亡，利于腫瘤生長［4］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，阿司匹林和其他非甾體類抗炎藥能通過抑制COX-2活性，使結(jié)腸癌發(fā)病率、死亡率明顯降低［5］。OSU-03012是COX-2抑制劑的衍生物，在人體內(nèi)生物活性高，雖缺乏COX-2抑制活性，但在動物實驗中發(fā)現(xiàn)其具有比COX-2抑制劑更強的抗癌作用［6］。另有研究顯示，OSU-03012可增強拉帕替尼抗腫瘤作用，而拉帕替尼也可增強OSU-03012的殺滅腫瘤細胞的毒性作用，且兩者抗腫瘤具有協(xié)同作用，當聯(lián)合作用于癌細胞時，可協(xié)同使AKT和ERK1/2活性降低［7］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、1 μmol/L 組、3μmol/L組、5 μmol/L組和10 μmol/L組細胞抑制率呈逐漸升高趨勢，細胞遷移距離及細胞遷移數(shù)目呈逐漸減小或降低趨勢，提示OSU-03012干預(yù)后細胞增殖和遷移能力明顯受到影響，且OSU-03012濃度越高，細胞增殖和遷移抑制越明顯，考慮這可能與細胞周期的阻滯在G0～G1期以及遷移相關(guān)蛋白表達抑制有關(guān)。

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Caspase-3 protein and mRNA between five groups表3 各組Bcl-2、Caspase-3蛋白和mRNA表達情況比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Caspase-3 protein and mRNA between five groups表3 各組Bcl-2、Caspase-3蛋白和mRNA表達情況比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；abc分別與對照組以及1、3 μmol/L組比較，P＜0.05

組別對照組1 μmol/L組3 μmol/L組5 μmol/L組10 μmol/L組F Bcl-2蛋白0.39±0.04 0.34±0.05 0.29±0.05a 0.21±0.04abc 0.15±0.03abc 15.462＊＊mRNA 0.95±0.21 0.86±0.14 0.63±0.12a 0.54±0.15a 0.31±0.12ab 8.540＊＊Caspase-3蛋白0.32±0.04 0.54±0.07a 0.63±0.09a 0.77±0.09ab 0.81±0.11ab 16.694＊＊mRNA 1.05±0.24 1.24±0.20 1.78±0.22ab 1.98±0.26ab 2.35±0.29abc 14.353＊＊

Fig.6 The expressions of Bcl-2 and Caspase-3 detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測Bcl-2和Caspase-3表達情況

細胞凋亡是細胞程序性死亡的過程，凋亡細胞染色質(zhì)凝集，DNA片段化，被巨噬細胞吞噬，此過程中不產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［8-9］。Bcl-2是調(diào)節(jié)細胞凋亡的主要因子，可抑制細胞凋亡，提高細胞存活率，其作用機制是阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最后共同通路，從而發(fā)揮抑制凋亡作用，對正常細胞周期不產(chǎn)生影響［10-11］。Caspase-3是Caspase家族中的一員，存在形式多為非活性酶原，在凋亡信號作用下激活，可將細胞周期進一步阻滯，最終導(dǎo)致核皺縮、染色體聚集、凋亡小體形成，是細胞凋亡的執(zhí)行蛋白，常用作細胞凋亡程度的評估指標之一［12］。本研究結(jié)果顯示，對照組、1 μmol/L組、3 μmol/L組、5 μmol/L組及10 μmol/L組凋亡率呈逐漸上升趨勢；整體而言，隨濃度增加Bcl-2蛋白表達呈逐漸下降趨勢，Caspase-3蛋白表達呈逐漸上升趨勢，提示OSU-03012可能通過下調(diào)Bcl-2表達，上調(diào)Caspase-3表達實現(xiàn)促進結(jié)腸癌細胞凋亡作用，且OSU-03012濃度越高，促凋亡作用越明顯，其作用機制考慮與OSU-03012抑制PI3K/PDK1/AKT信號通路中PDK1和AKT活性有關(guān)。研究顯示，被激活的PI3K可激活PDK1，PDK1通過磷酸化使部分活化的AKT達到完全活化的狀態(tài)，進而間接或直接調(diào)控Bcl-2和Caspase-3蛋白表達，發(fā)揮促進癌細胞凋亡的作用［3，13］。

綜上所述，新化合物OSU-03012抗結(jié)腸癌的機制可能與抑制結(jié)腸癌細胞增殖、遷移，促進結(jié)腸癌細胞凋亡有關(guān)，而OSU-03012促進結(jié)腸癌細胞凋亡可能通過下調(diào)Bcl-2表達、上調(diào)Caspase-3表達實現(xiàn)，且其抑制癌細胞增殖、遷移、促進細胞凋亡方面具有一定的劑量依懶性。