張芳菲, 曹佳欣, 王晨紅, 毛懿杰, 華倩倩, 劉淑賢, 譚 峰, 胡 昕

剛地弓形蟲廣泛寄生于人和動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi)，引起弓形蟲病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有1/3人群屬于弓形蟲隱性感染人群[2]。當(dāng)機(jī)體免疫力受損或抑制，緩殖子期可轉(zhuǎn)化為速殖子期，在患者體內(nèi)播散，造成多器官炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重可致死亡[3-4]。然而目前對(duì)弓形蟲病的治療主要針對(duì)的是顯性感染階段速殖子，無(wú)法根除隱性感染人群體內(nèi)的緩殖子，阻礙了疾病的治療[5]。

沉默信號(hào)調(diào)節(jié)子2(Silent information regulator 2, Sir2)，是一類高度保守的、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)，屬第III類HDAC家族——sirtuins家族[6-7]，其底物包括組蛋白、非組蛋白等多種蛋白[7]。

Sir2最早發(fā)現(xiàn)于酵母細(xì)胞中，隨后在多種原核、真核細(xì)胞中被證實(shí)。人體內(nèi)，Sir2被命名為SIRT2。SIRT2既可定位胞漿，也可入核，對(duì)胞漿蛋白、組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行去乙?；揎棧瑓⑴c微管動(dòng)力學(xué)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控等許多生理和細(xì)胞活動(dòng)，與腫瘤、衰老、II型糖尿病等疾病密切相關(guān)[7]。

然而，在弓形蟲體內(nèi)尚未見TgSir2蛋白的相關(guān)研究報(bào)道。據(jù)此，本研究利用生物信息學(xué)分析方法，在弓形蟲基因組中挖掘出與酵母細(xì)胞TgSir2蛋白的同源蛋白，通過(guò)原核表達(dá)TgSir2，制備其多克隆抗體，為進(jìn)一步研究該蛋白功能提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1蟲株、質(zhì)粒、菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 弓形蟲RH株速殖子、人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)、原核表達(dá)載體pET28b、大腸埃希菌(E.coli)DH5α和BL21均為本實(shí)驗(yàn)室保存，新西蘭大白兔購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)ToxoDB中TgSir2基因編碼序列(TGGT1_227020)，分別設(shè)計(jì)去除信號(hào)肽片段的上游引物(TgSir2△1-15aa-F: 5′GAATTCTTGCCTCTTTGAGCCTCATGAAC-3′)和下游引物(TgSir2△1-15aa-R: 5′-GCGGCCGCCTATCTCCTTTGCAGCGCC-TT-3′)，下劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI的酶切位點(diǎn)。引物由上海祥音生物科技有限公司合成。

1.1.3主要試劑 Trizol Reagent試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0購(gòu)自日本Takara公司；KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit購(gòu)自美國(guó)KAPA Biosystems公司；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA Bio-tek公司；限制性內(nèi)切酶NotI、EcoRI和T4 DNA連接酶購(gòu)美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；GoTaqTMGreen Master Mix購(gòu)自美國(guó)Promega公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)自瑞士Roche 生物公司；蛋白純化鎳柱Ni-NTA Agarose購(gòu)自QIAGEN公司；鼠源抗His單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CMCTAG公司；Dlight 488山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)EarthOx life science公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體、山羊抗兔 IgG 抗體購(gòu)自合肥市Biosharp生物科技公司，0.22 μm PVDF轉(zhuǎn)移膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 方 法

1.2.1生物學(xué)信息分析 在弓形蟲數(shù)據(jù)庫(kù)ToxoDB中，采用Blast序列比對(duì)軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，尋找與酵母Sir2相似性最高的蛋白序列，并利用ClustalW軟件將TgSir2與其他物種Sir2同源物進(jìn)行同源比對(duì)。

1.2.2目的片段擴(kuò)增將RH株速殖子在HFF宿主細(xì)胞中常規(guī)培養(yǎng)(1%胎牛血清的DMEM)。待蟲體完全出胞后，將蟲體經(jīng)3 μm濾器純化后以Trizol法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，擴(kuò)增TgSir2△1-15aa編碼序列(去除1-15位氨基酸的編碼序列)反應(yīng)體系為：cDNA(<1 ng)，上、下游引物(10 nmol)各1.5 μL，2×Kapa HiFi hotstart ready mix 25 μL，加去離子水至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。

1.2.3重組質(zhì)粒pET28b-TgSir2△1-15aa的構(gòu)建與鑒定 用NotI和EcoRI酶分別雙酶切pET-28b載體、PCR目的片段。膠回收酶切產(chǎn)物，連接后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂Kan LB固體培養(yǎng)基平板篩選陽(yáng)性單克隆，提質(zhì)粒通過(guò)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定后，陽(yáng)性質(zhì)粒送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4TgSir2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，經(jīng)IPTG于16 ℃ 220 r/min振蕩誘導(dǎo)22 h。將誘導(dǎo)后產(chǎn)物離心收集菌體，超聲裂解后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，鎳柱純化上清中的TgSir2融合蛋白，隨后以小鼠抗His單克隆抗體作為一抗(1∶1 000)，羊抗小鼠HRP-IgG作為二抗(1∶5 000)，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)與Western blotting分析。

1.2.5抗體制備 將純化后的TgSir2融合蛋白背部皮下多點(diǎn)注射免疫2只新西蘭大白兔，初次免疫以1 mg，之后每隔15 d，0.5 mg抗原加強(qiáng)免疫1次，共4次。

1.2.6抗體效價(jià)和特異性鑒定 免疫結(jié)束后，采集兔血清，以His-TgSir2△1-15a蛋白包被酶標(biāo)板，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)免疫后兔血清抗體效價(jià)。待血清效價(jià)達(dá)到1∶64 000后常規(guī)心臟取血，收集兩只兔血清，分別命名為1號(hào)和2號(hào)免疫兔抗TgSir2血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)將純化的His-TgSir2△1-15a蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，后依次用經(jīng)親和層析純化的1號(hào)和2號(hào)免疫兔抗TgSir2多克隆抗體作為一抗，羊抗兔HRP-IgG作為二抗，電化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，觀察結(jié)果。

1.2.7多抗識(shí)別弓形蟲內(nèi)源性TgSir2將從弓形蟲中提取的蛋白(按步驟1.2.2收集弓形蟲RH株速殖子，超聲裂解蟲體后，取上清)行SDS-PAGE后，以制備的兔抗TgSir2多克隆抗體(1∶500)作為一抗，羊抗兔HRP-IgG(1∶5000)作為二抗，Western blotting檢測(cè)抗體特異性。HFF細(xì)胞提取的蛋白為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1生物學(xué)信息分析 通過(guò)Blast軟件發(fā)現(xiàn)一個(gè)TgSir2基因(ToxoDB：TGGT1_227020)，其在ToxoDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因注釋為組蛋白去乙酰化酶。利用ClustalW進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)雖然TgSir2與酵母、人Sir2相似性較低，但其酶活性中心卻高度保守，尤其是與瘧原蟲Sir2蛋白相似性最高(圖1A)。用Signal 4.1軟件對(duì)其表達(dá)的蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)TgSir2蛋白存在一段長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸的信號(hào)肽(圖1B)。

2.2TgSir2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 TgSir2△1-15aa基因片段的理論大小為1 038 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在約1 000 bp處可見一條清晰的特異性擴(kuò)增條帶，與TgSir2△1-15aa基因片段的理論大小(1 038 bp)一致(圖2)。

M：DNA標(biāo)志物；1：TgSir2△1-15aa基因PCR產(chǎn)物

2.3重組質(zhì)粒pET28b-TgSir2△1-15aa的鑒定 重組質(zhì)粒pET28b-TgSir2△1-15aa經(jīng)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，目的基因片段均約為1 000 bp(圖3)，測(cè)序表明pET28b-TgSir2質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.4TgSir2融合蛋白的表達(dá)、純化和鑒定 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET28b-TgSir2轉(zhuǎn)化至BL21表達(dá)菌中，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)鎳柱純化，SDS-PAGE檢測(cè)可見大量目的蛋白，其蛋白大小符合預(yù)

a表示構(gòu)成酶活性的關(guān)鍵氨基酸殘基；b表示NAD+結(jié)合位點(diǎn)；c表示既可結(jié)合NAD+，同時(shí)也是酶活性關(guān)鍵氨基酸殘基；d表示構(gòu)成鋅指結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵氨基酸殘基。

M：DNA標(biāo)志物；1：陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物；2：pET28b；3：pET28b-TgSir2重組質(zhì)粒；4：pET28b-TgSir2重組質(zhì)粒雙酶切

期(圖4A)。隨后經(jīng)Western blotting檢測(cè)，TgSir2融合蛋白能被小鼠抗His單克隆抗體識(shí)別，在相應(yīng)分子量大小處有特異條帶(圖4B)。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)志物；1：誘導(dǎo)后樣品；2：誘導(dǎo)前樣品；3：PBS洗脫液；4：純化后融合蛋白；5. 純化后融合蛋白

2.5兔抗TgSir2多克隆抗體鑒定 經(jīng)4次免疫后，以免疫前兔血清為對(duì)照，ELISA法測(cè)定2只免疫兔抗His-TgSir2血清效價(jià)均達(dá)1∶64 000。將2只兔血清收集后經(jīng)親和層析純化，Western blotting檢測(cè)顯示，所制備的抗體能夠特異性識(shí)別原核表達(dá)

的TgSir2融合蛋白(圖5)。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)志物；1：1號(hào)免疫兔抗TgSir2多克隆抗體作為一抗(1∶8 000)；2：1號(hào)免疫兔抗TgSir2多克隆抗體作為一抗(1∶16 000)；3：2號(hào)免疫兔抗TgSir2多克隆抗體作為一抗(1∶8 000)；4：2號(hào)免疫兔抗TgSir2多克隆抗體作為一抗(1∶16 000)

2.6評(píng)價(jià)兔抗TgSir2多克隆抗體識(shí)別弓形蟲內(nèi)源性TgSirt蛋白的能力 提取弓形蟲全蟲蛋白，經(jīng)SDS-PAGE與Western blotting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兔抗TgSir2多克隆抗體不但可以與預(yù)期大小的目的條帶(圖6箭頭所指處)特異性結(jié)合，同時(shí)在70 kDa左右也有一條反應(yīng)條帶。而宿主細(xì)胞對(duì)照組作為陰性對(duì)照，與兔抗TgSir2無(wú)特性性結(jié)合(圖6)。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)志物；1：弓形蟲速殖子全蟲蛋白；2：HFF細(xì)胞蛋白

3 討 論

Sir2同源物目前已在溶組織內(nèi)阿米巴[8]、錐蟲[9-11]、利什曼原蟲[12-14]、瘧原蟲[15-16]等多種寄生性原蟲體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，其功能涉及修復(fù)損傷DNA[11]、參與蟲體入侵與增殖[10, 17]、調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答[11-12]、調(diào)控蟲體抗原變異基因從而逃避宿主免疫應(yīng)答[18]等。因此，在多種寄生性原蟲病防治中，Sir2蛋白是一個(gè)具有研發(fā)前景的藥物、疫苗靶點(diǎn)[18-22]。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，TgSir2蛋白無(wú)法利用傳統(tǒng)的double-crossover策略進(jìn)行基因敲除，提示該蛋白是蟲體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的必需蛋白。

Sir2結(jié)構(gòu)中包含了保守的NAD+結(jié)合域和2個(gè)酶活性核心域：Rossmann折疊構(gòu)成大結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)(CX2CX20CX2C)構(gòu)成小結(jié)構(gòu)域。在2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的縫隙中，乙酰化肽段與NAD+結(jié)合形成酶-底物結(jié)構(gòu)而發(fā)生催化反應(yīng)[3]。通過(guò)蛋白質(zhì)同源性分析，我們發(fā)現(xiàn)，雖然TgSir2蛋白與其他種屬Sir2蛋白的序列相似度較低，但是核心功能域高度保守。這預(yù)示著TgSir2在弓形蟲中可能具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)去乙?；墓δ?。隨后，我們通過(guò)信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TgSir2蛋白可能作為一種分泌蛋白發(fā)揮作用。而這一信號(hào)肽在其他物種Sir2蛋白中尚未發(fā)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)原核表達(dá)并純化了重組TgSir2蛋白，并以此為抗原成功制備了效價(jià)達(dá)1∶64 000的兔抗TgSir2多克隆抗體，適合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步的Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該多抗既可識(shí)別原核表達(dá)的TgSir2融合蛋白，也可識(shí)別弓形蟲體內(nèi)的內(nèi)源性TgSir2蛋白。然而，在多抗識(shí)別內(nèi)源性TgSir2蛋白的Western blotting實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)該抗體與蟲體蛋白反應(yīng)后，不但出現(xiàn)了預(yù)期大小的目的條帶，還出現(xiàn)了一條分子量更大的蛋白條帶。盡管經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，該條帶仍然存在，而對(duì)照組宿主細(xì)胞中卻并未檢測(cè)到任何條帶，因此，我們認(rèn)為本研究中所制備的抗體是特異針對(duì)弓形蟲蛋白的多克隆抗體。由于該條帶的大小接近于目的條帶的兩倍，我們推測(cè)可能由以下3個(gè)原因：1)TgSir2在弓形蟲體內(nèi)很可能以二聚體的形式存在并發(fā)揮生物學(xué)功能；2)作為一種修飾酶，TgSir2在弓形蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中與某種蛋白發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，從而發(fā)揮作用；3)該抗體除了可以識(shí)別弓形蟲TgSir2蛋白，還可能與蟲體內(nèi)某種分子量約70 kDa的蛋白結(jié)合。以上推測(cè)，我們將在后續(xù)研究中進(jìn)一步通過(guò)親和層析與質(zhì)譜分析進(jìn)行驗(yàn)證。

由于本實(shí)驗(yàn)已證實(shí)所制備的兔抗TgSir2多克隆抗體可識(shí)別弓形蟲內(nèi)源性TgSir2，這將為進(jìn)一步研究弓形蟲內(nèi)的TgSir2分子機(jī)制及去乙?；揎棛C(jī)制提供了必要的實(shí)驗(yàn)工具。

利益沖突：無(wú)