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內臟利什曼病(黑熱病)是由親內臟的利什曼原蟲感染所致的嚴重危害人類健康的重要人獸共患寄生蟲病。利什曼病由媒介白蛉叮咬傳播。初始感染媒介的利什曼原蟲位于白蛉胃腸道，并無感染力，經過發(fā)育繁殖利什曼原蟲逐漸獲得了感染力，一周后原蟲向白蛉消化道前部運動，并聚集在白蛉咽、口腔和喙部，當白蛉叮咬人時將利什曼原蟲注入人體，侵入人體巨噬細胞而感染。因此，比較利什曼原蟲有毒株和無毒株前鞭毛體表達分子差異將有助于鑒定涉及感染的利什曼原蟲關鍵分子。

利什曼原蟲基因表達主要表現(xiàn)為轉錄后和翻譯后調節(jié),導致了基因、mRNA和蛋白質表達間相關性程度極低[1]。通過對同一分離株的有毒株和無毒株進行蛋白質組學比較分析則易于發(fā)現(xiàn)和鑒定與感染相關的蛋白分子。利什曼原蟲在培養(yǎng)基中培養(yǎng)會逐漸失去毒力，最終失去對動物模型的感染力，這些無毒株相似于媒介白蛉消化道內無感染力的前鞭毛體；而分離的利什曼原蟲經動物傳代(取感染動物的脾臟置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得的前鞭毛體再感染動物，如此反復)其前鞭毛體能始終保持著毒力。

非標記(Label-free )定量蛋白質組學技術是近年發(fā)展起來的較敏感的蛋白質組學技術， 得到了廣泛的應用[2]。本研究采用此蛋白質組學技術比較分析了分離于我國新疆伽師縣黑熱病患者的利什曼原蟲(嬰兒利什曼原蟲，致荒漠型黑熱病[3])有毒株和無毒株蛋白質表達的差異，其結果為篩選和鑒定與利什曼原蟲感染相關的關鍵分子奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1蟲株 嬰兒利什曼原蟲伽師株(MHOM/CN/08/JIASHI-5)于2008年分離于新疆伽師縣黑熱病患者，經鑒定為嬰兒利什曼原蟲[3]。該地為荒漠型內臟利什曼病疫區(qū)。該蟲株通過兩種方式在本實驗室傳代，一是每3個月感染1次金色倉鼠(購買自上海松江淞聯(lián)實驗動物廠，由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所動物中心飼養(yǎng)，經過該所實驗動物福利倫理委員會審批同意使用)，即取感染鼠脾臟體外3代次培養(yǎng)，獲取前鞭毛體再感染鼠，使其始終保持感染力(有毒株)，二是從2008年開始一直在NNN培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每月傳代1次，其前鞭毛體已失去了對動物模型的感染力(無毒株)。

1.2試劑與儀器 199培養(yǎng)基干粉購自德國Gibco，胎牛血清購自美國ScienCell，Hepes購自上海怡成生物科技有限公司，瓊脂粉購自香港Gene Company Ltd.，青霉素鈉、鏈霉素購自石家莊華北制藥股份有限公司，氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、磷酸氫鈉及葡萄糖購自北京國藥集團化學試劑有限公司，DTT、Urea、IAA乙腈和BCA 蛋白測定試劑盒購自美國Bio-Rad公司，Trypsin購自美國Promega公司，Q-exacitve質譜儀、HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1000和色譜柱RP-C18購自美國Thermo公司。

1.3 培養(yǎng)基的配制

1.3.1NNN培養(yǎng)基 取新西蘭兔血，去除纖維， 加入100單位/100 mL的青霉素鈉。3.4 g瓊脂粉、1 g氯化鈉及150 mL蒸餾水配置瓊脂凝膠。0.45 g氯化鈉、0.01 g氯化鈣、0.02 g氯化鉀、0.01 g碳酸氫鈉、0.125 g葡萄糖及50 mL蒸餾水配置洛克氏液。 1 mL前述兔血加入3 mL高壓滅菌的瓊脂凝膠，混勻后斜放在冰塊上冷卻，凝固形成斜面后每管再加入1 mL洛克氏液，存放于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2199培養(yǎng)基 將9.8 g M199培養(yǎng)基干粉加蒸餾水溶解，加入1.75 g碳酸氫鈉及5.96 g Hepes，完全溶解后定容至1 000 mL。胎牛血清56 ℃滅活30 min，每100 mL M199加入20 mL胎牛血清及100單位/100 mL 雙抗(青霉素及鏈霉素)。隨后應用0.22 μm的濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4有毒株和無毒株鞭毛體的收集 取嬰兒利什曼原蟲伽師株第一代次感染的金色倉鼠脾臟置NNN培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨后前鞭毛體再接種到199培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)。在原蟲處于對數生長期，原蟲密度約為106/mL時，4 ℃下以3 000 g離心15 min收集有毒株前鞭毛體，用PBS洗3次后備用。同法收集NNN培養(yǎng)基傳代的伽師無毒株鞭毛體。

1.5蛋白質的制備 有毒株和無毒株各取100 μL壓積量，分別加入500 μL STD buffer(4% SDS,1 mmol/L DTT, 150 mmol/L Tris-HCl pH8.0)，勻漿混勻，沸水浴5 min。超聲破碎(80 w，超聲10 s，間歇15 s，共10次)沸水浴5 min，離心取上清，BCA法蛋白質定量。取約20 μg SDS-PAGE電泳檢測。

1.6蛋白質的FASP酶解 蛋白質的酶解方法參照文獻[4]。取200 μg樣品，加入 DTT至終濃度為100 mmol/L，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入200 μL UA buffer(8 mol/L Urea，150 mmol/L Tris-HCl pH8.0)混勻，轉入10 kd超濾離心管，離心14 000 g 15 min。加入200 μL UA buffer離心14 000 g 15 min，棄濾液。加入100 μL IAA(50 mmol/L IAA in UA)，600 r/min振蕩1 min，避光室溫30 min，離心14 000 g 10 min。加入100 μL UA buffer，離心14 000 g 10 min重復2次。加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，離心14 000 g 10 min重復2次。加入40 μL Trypsin buffer(4 μL Trypsin in 40 μL NH4HCO3)，600 r/min振蕩1 min，37 ℃ 16～18 h。換新收集管，離心14 000 g 10 min，取濾液，OD280肽段定量。

1.7酶解產物的LC-MS/MS分析 分析方法參照文獻[5]。取2 μg酶解后產物采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1000進行分離。液相A液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為2%)，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm (RP-C18)以100%的A液平衡。樣品由自動進樣器上樣到Thermo EASY column SC001 traps 150 μm×20 mm (RP-C18)，再經色譜柱分離，流速為300 nL/min。相關液相梯度如下：0～110 min，B液線性梯度從0%到45%；110～117 min，B液線性梯度從45%到100%；117～120 min，B液維持在100%。酶解產物經毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析。分析時長：120 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：300～1 800 m/z，多肽和多肽的碎片的質量電荷比按照下列方法采集：MS1在M/Z 200時分辨率為70 000，AGC target：3e6，一級Maximum IT：10 ms，Number of scan ranges ：1，Dynamic exclusion：40.0 s；每次全掃描(full scan)后采集20個碎片圖譜，二級在M/Z 200時分辨率為17 500，MS/MS Activation Type：HCD，Isolation window：2 m/z，Microscans：1，二級Maximum IT ：60 ms，Normalized collision energy：30eV，Underfill ratio：0.1%。

1.8MaxQuant查庫 原始文件導入MaxQuant軟件(版本號1.3.0.5)進行查庫[6]。查庫所用的數據庫為uniprot_Leishmania_genus_50931_20160303 .fasta (蛋白質序列50 931條，下載日期20160303)。

1.9生物信息學分析 MaxQuant所得的查庫文件使用Perseus軟件進行分析，Perseus軟件版本號為1.3.0.5。使用Omicsbean(http://www.omicsbean.cn/)進行差異表達蛋白質的生信分析，包括GO富集和KEGG富集分析[7]。

1.10統(tǒng)計分析 對兩組樣品進行t檢驗(雙側)，差異倍數>1.2或者差異倍數<0.83,且P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1蛋白質鑒定 利用Label-free定量蛋白組學技術共成功鑒定蛋白3 994個(舍棄只有一次有LFQ值的蛋白)，其中有毒株3 720個蛋白，無毒株3 827個蛋白。利用SPSS軟件篩選出有毒株和無毒株之間差異表達蛋白，共298個(差異倍數>1.2或者差異倍數<0.83，P<0.05)，其中利什曼原蟲有毒株特有表達蛋白15個，無毒株特有表達蛋白23個(圖1)。二者間差異表達蛋白260個，其中有毒株表達上調蛋白78個，表達下調蛋白182個。

圖1 利什曼原蟲伽師有毒株和無毒株差異表達蛋白韋恩圖Fig.1 Venn diagram of differentially expressed proteins between the virulent promastigotes and avirulent promastigotes in the Jiashi Leishmania strain

2.2差異表達蛋白功能注釋 對有毒株和無毒株差異表達蛋白進行生物信息學分析結果顯示，只在有毒株表達而在無毒株不表達的蛋白有15個，其中13個為未命名蛋白，另外2個蛋白分別是甲基丙二酸單酰CoA差向異構酶(Methylmalonyl-CoA epimerase，MMCE)和乙酰轉移酶，均參與代謝和生物合成。只在無毒株表達而在有毒株不表達的蛋白有23個， 其中13個為未命名蛋白，另外10個蛋白分別參與下列活動 :1)代謝和生物合成(MP67、穹隆體主蛋白、胞質FE-S簇裝配因子NUBP1同源物、3-β-羥基甾體-δ(8)，δ(7)異構酶、鈣蛋白酶樣半胱氨酸肽酶和外切體復合物核酸外切酶Rrp40);2)定位和轉運(網格蛋白裝配蛋白和tRNA(鳥嘌呤(37)-N1)甲基轉移酶);3)細胞膜/細胞骨架形成(動力蛋白輕鏈蛋白和肌球蛋白-IB重鏈)。有毒株表達上調蛋白主要參與細胞氮化合物代謝、細胞氮化合物生物合成、細胞酰胺代謝等生物過程；具有核酸結合、RNA結合、結構分子活性等分子功能；存在于細胞內成分、細胞質、非膜結合細胞器等細胞組分中(圖2)。有毒株表達下調蛋白其功能主要涉及有機酸代謝、酮酸代謝、羧酸代謝等生物過程；具有催化活性、氧化還原酶活性、內肽酶活性等分子功能；存在于細胞內成分、細胞器、線粒體等細胞組分中(圖3)。

圖2 有毒株表達上調蛋白的生物學過程、細胞成分和分子功能富集圖Fig.2 Biological process, cell composition and molecular function enrichment diagram of up-regulated proteins in virulent strain

圖3 有毒株下調蛋白的生物學過程、細胞成分和分子功能富集圖Fig.3 Biological process, cell composition and molecular function enrichment diagram of down-regulated proteins in virulent strain

2.3差異表達蛋白通路富集分析 對有毒株表達上調蛋白和下調蛋白分別進行信號轉導通路富集分析，結果顯示表達上調蛋白參與了核糖體、吞噬體、醚脂代謝等信號轉導通路(圖4)；表達下調蛋白參與了丙酮酸代謝、次生代謝物的生物合成、抗生素的生物合成等信號轉導通路(圖5)。

圖4 有毒株表達上調蛋白的通路富集圖Fig.4 Pathways enrichment diagram of up-regulated proteins in virulent strain

圖5 有毒株表達下調蛋白的通路富集圖Fig.5 Pathways enrichment diagram of down-regulated proteins in virulent strain

3 討 論

本研究應用非標記高通量蛋白質組研究技術對分離于我國新疆伽師縣致荒漠型黑熱病的利什曼原蟲有毒株和無毒株進行了蛋白質組學分析，共鑒定蛋白3 994個，遠高于其他蛋白質組方法鑒定的蛋白數[8]。本研究結果顯示，298個蛋白在有毒株和無毒株間的表達存在差異(特異表達或表達豐度差異)。這些差異表達蛋白中確定功能的蛋白分別參與糖與脂質代謝、核酸代謝、壓力反應、細胞骨架形成、細胞周期與增殖等活動。

甲基丙二酸單酰CoA差向異構酶只在有毒株特異表達，此蛋白與降解奇鏈脂肪酸相關[9]。磷酸甘露聚糖酶在有毒株表達上調，此蛋白催化甘露糖-6-磷酸轉化為甘露糖-1-磷酸,這是真核生物甘露醇的激活和糖復合物的生物合成的重要步驟。磷酸甘露聚糖酶缺失的墨西哥利什曼原蟲失去毒力，表明該蛋白是重要的毒力因子[10]。肌醇鞘磷脂磷脂酶C(Inositol phosphosphingolipid phospholipase C-Like，ISCL)在有毒株中高表達，研究表明ISCL缺失的碩大利什曼原蟲不能使易感的BALB/c小鼠感染急性期產生病理改變[11]。ISCL介導的肌醇磷酸神經酰胺(inositol phosphorylceramide，IPC)的降解在養(yǎng)分耗盡時對利什曼原蟲的生長起重要作用，并提高利什曼原蟲的耐酸機能[12]。巨噬細胞產生的活性氧和氮類物質(ROS和RNS)是殺滅細胞內病原體的最常見的武器。而利什曼原蟲作為巨噬細胞內寄生的病原體具有通過抵抗感染過程中產生的有毒氧代謝物以增強生存能力的機制。在這種抗氧化機制中，多胺很大程度上取決于細胞內L-精氨酸的有效性。本研究顯示在有毒株S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)表達上調，此蛋白是利什曼原蟲多胺合成的一個關鍵酶[13-14]。另一個上調蛋白精氨琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase，ASS)是與利什曼原蟲發(fā)病機制相關的活性酶，可以將細胞內L-瓜氨酸轉化為精氨琥珀酸鹽以提供精氨酸，表明ASS是利什曼原蟲能在壓力環(huán)境中生存的重要蛋白，有望被用作抗利什曼原蟲藥物靶標[15-16]。上調蛋白抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)是抗氧化酶類，在分解過氧化氫中起關鍵作用[17-18]。無鞭毛蛋白(amastin)在有毒株高表達，此蛋白是由利什曼原蟲基因組中巨大的基因家族編碼的表面糖蛋白。有研究顯示敲除編碼無鞭毛蛋白基因的巴西利什曼原蟲在小鼠巨噬細胞體外感染中表現(xiàn)為生長障礙而不能感染BALB/c小鼠[19]。表面蛋白2(Parasite surface antigen protein 2,PSA-2)是利什曼原蟲的一個毒力因子，參與蛋白質-蛋白質相互作用和信號轉導，能夠抵制補體介導的溶菌作用，增強利什曼原蟲感染宿主的能力[20-22]。在本研究中PSA-2在有毒株中高表達。另有研究表明杜氏利什曼原蟲分離株中PSA-2的過表達導致銻劑敏感株轉變?yōu)榭逛R株，提示PSA-2可以作為區(qū)分對銻劑敏感株和抗性株的分子標志物[23]。

綜上所述，通過比較利什曼原蟲伽師有毒株和無毒株蛋白質組分析發(fā)現(xiàn)兩者蛋白質組存在相當差異性，在有毒株高表達的蛋白大都是毒力因子，涉及利什曼原蟲對宿主細胞的感染及在感染細胞中生存，從而賦予利什曼原蟲毒力。下一步擬對一些有代表性的與利什曼原蟲感染相關的關鍵分子基因進行Real time PCR驗證是否在轉錄水平上調或下調；應用Western blot進一步證實這些關鍵分子的蛋白表達水平是否上調或下調，對驗證成功的蛋白通過基因敲除的方法進行進一步研究，不僅可為篩選和鑒定與利什曼原蟲感染相關關鍵分子奠定基礎，而且為抗利什曼病的疫苗和藥物的研究提供靶分子。

利益沖突：無