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        不同生理階段及性別SPF級(jí)BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠血液生理生化指標(biāo)測(cè)定與比較

        2019-03-07 06:21:26黎桂玲黎雄才鄺少松
        廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年12期
        關(guān)鍵詞:周齡血常規(guī)生理

        黎桂玲,劉 科,黎雄才,鄺少松,王 剛

        (廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣東 佛山 528248)

        【研究意義】BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中常見的近交系小鼠,在經(jīng)過至少20代以上近交后,基因的純合性(遺傳位點(diǎn)純合度大于98.6%)、表型的一致性、遺傳的穩(wěn)定性、背景資料的完整性與分布的廣泛性[1]已眾所周知。血液生理生化指標(biāo)不僅反映動(dòng)物的生理狀態(tài)和健康狀態(tài),還可以評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)性能和生產(chǎn)性能,對(duì)評(píng)價(jià)動(dòng)物的代謝狀況、生理狀態(tài)和飼養(yǎng)管理具有重要意義。同時(shí),血液生理生化指標(biāo)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化的重要內(nèi)容,也是腫瘤學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)、生理學(xué)、藥學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域常用的指標(biāo)[2-8],具有重大的臨床診斷意義。小鼠是常用且應(yīng)用最廣的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一,是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中培育品種品系最多的動(dòng)物,小鼠正常血液生理生化指標(biāo)的測(cè)定與比較對(duì)醫(yī)學(xué)等研究具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】迄今已有對(duì)15~20 g(3~4周齡)小鼠[9-10]、4~6月齡轉(zhuǎn)基因小鼠[11]等小鼠的血液生理生化指標(biāo)變化進(jìn)行比較分析,均表明不同品系小鼠在離乳或相關(guān)表達(dá)性狀開始出現(xiàn)等狀態(tài)下部分血液生理生化指標(biāo)存在一定差異?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】小鼠成熟早,繁殖力強(qiáng)[12],6周齡、9周齡時(shí)分別處于性成熟、體成熟階段[13]。但對(duì)與小鼠繁殖性能相關(guān)的生理階段所處年齡和性別的血液生理生化研究分析較少?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對(duì)6周齡和9周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠進(jìn)行血常規(guī)、血生化參數(shù)進(jìn)行測(cè)定及比較,進(jìn)一步了解常用近交系小鼠不同性別及所處不同生理階段與繁殖性能相關(guān)的血常規(guī)與血生化參數(shù)的差異性,為科研工作者及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用者對(duì)近交系小鼠的應(yīng)用與研究提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        供試SPF級(jí)BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠各120只,其中6周齡、9周齡各60只,雌雄各半,均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK粵2018-0002。飼料為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的無(wú)菌繁殖鼠料,合格證號(hào)為粵飼證(2019)05073。

        主要試劑:DS稀釋液、M-52DIFF溶血?jiǎng)?、M-52LH溶血?jiǎng)?gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;ALT、AST、ALP、CK、TP、ALB、GLOB、GLU、BUN、CREA、TC、TG,購(gòu)自上??迫A生物工程股份有限公司。

        主要儀器:全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(Mindray BC-5000,中國(guó))、低速離心機(jī)(TDL-5-A,中國(guó))、全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI 7020,日本)。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 飼養(yǎng)方法 BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠均飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障設(shè)施中,溫度控制在20~26℃,相對(duì)濕度約60%。光照周期為10 h明/14 h暗,換氣次數(shù)大于20次/h。飲用水均經(jīng)過高溫滅菌,紫外照射消毒。自由采食、飲水。籠具與飼料按2次/周進(jìn)行更換,均經(jīng)過嚴(yán)格的高溫蒸汽滅菌消毒,進(jìn)出屏障設(shè)施均嚴(yán)格遵守相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

        1.2.2 血液標(biāo)本的采集 2018年12月至2019年1月,隨機(jī)抽取6周齡和9周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠各60只,雌雄各半,禁食12 h過夜。每只小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉麻醉,于眼眶靜脈叢分別采取0.5 mL全血于EDTA K2抗凝管、1.5 mL離心管中,離心管在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min。

        1.2.3 血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 利用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)小鼠全血血常規(guī)指標(biāo),包括白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(NE)、淋巴細(xì)胞(LY)、單核細(xì)胞(MO)、嗜酸性粒細(xì)胞(EO)、嗜堿性粒細(xì)胞(BA)、中性粒細(xì)胞比率(NE%)、淋巴細(xì)胞比率(LY%)、單核細(xì)胞比率(MO%)、嗜酸性粒細(xì)胞比率(EO%)、嗜堿性粒細(xì)胞比率(BA%)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、血小板(PLT)、血小板壓積(PCT)、平均血小板壓積(MPV)、血小板平均分布寬度(MDW)。

        1.2.4 血生化指標(biāo)檢測(cè) 利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清血生化指標(biāo),包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血清球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)。

        1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

        利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及差異性分析,組間差異分析用t檢驗(yàn)法。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 B ALB/c小鼠和C57BL/6小鼠的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

        2.1.1 BALB/c小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果 從BALB/c小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(表1)可知,6周齡雌、雄性小鼠的MO、NE%、LY%、MO%及PLT差異極顯著,NE及MPV差異顯著;6周齡與9周齡雌性小鼠的NE%、LY、HGB、HCT、MCV、RDW、PCT及MPV差異極顯著,NE及MO%差異顯著;9周齡雌、雄性小鼠的WBC、LY%、NE%、MCV、MCH及RBC差異極顯著,LY、HGB、HCT差異顯著;6周齡與9周齡雄性小鼠的 WBC、LY、EO、NE%、MO%、EO%、RBC、HGB、HCT、RDW、PCT、MPV、MDW差異極顯著,LY%差異顯著,其余檢測(cè)指標(biāo)差異不顯著。

        表1 6周齡和9周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Blood routine results of 6 weeks old and 9 weeks old SPF BALB/c mice

        2.1.2 C57BL/6小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果 從C57BL/6小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(表2)可知,6周齡雌、雄性小鼠血的MO、HCT、RBC差異極顯著,WBC、LY、MCH、MCHC、HGB差異顯著;6周齡與9周齡雌性小鼠的WBC、NE、MO、MO%、RDW差異極顯著,LY、NE%、LY%、MDW差異顯著;9周齡雌、雄性小鼠的RBC、MCH差異 極 顯 著,WBC、LY、MO、HCT、MCHC、PLT、MPV差異顯著;6周齡與9周齡雄性小鼠的 WBC、NE、MO、MO%、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW差異極顯著,LY、EO差異顯著,其余血常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)差異不顯著。

        表2 6周齡和9周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Blood routine results of 6 weeks old and 9 weeks old SPF C57BL/6 mice

        2.2 B ALB/c小鼠和C57BL/6小鼠的血生化檢測(cè)結(jié)果

        2.2.1 BALB/c小鼠血生化檢測(cè)結(jié)果 從BALB/c小鼠血生化檢測(cè)結(jié)果(表3)可知,6周齡雌、雄性小鼠的所有檢測(cè)指標(biāo)差異均不顯著;6周齡與9周齡雌性小鼠的ALP、GLU、CREA、TC、TG差異極顯著,AST、ALB、BUN差異顯著;9周齡雌、雄性小鼠的AST、ALP、TP、GLOB、A/G、TC、TG差異極顯著,BUN差異顯著;6周齡與9周齡雄性小鼠的ALP、TP、GLOB、A/G、BUN、CREA差異極顯著,ALT、GLU、TG差異顯著,其余檢測(cè)指標(biāo)差異不顯著。

        2.2.2 C57BL/6小鼠血生化檢測(cè)結(jié)果 從C57BL/6小鼠血生化檢測(cè)結(jié)果(表4)可知,6周齡雌、雄性小鼠的AST差異極顯著,其余檢測(cè)指標(biāo)差異不顯著;6周齡與9周齡雌性小鼠的ALP、TG差異極顯著,AST、TP、GLOB、A/G差異顯著;9周齡雌、雄性小鼠的所有檢測(cè)指標(biāo)差異均不顯著;6周齡與9周齡雄性小鼠的ALP、TP、GLOB、A/G、TG差異極顯著,TC差異顯著,其余檢測(cè)指標(biāo)差異不顯著。

        3 討論

        實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液生理生化指標(biāo)是判斷動(dòng)物健康狀況和選擇合格動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn),是臨床醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究的重要數(shù)據(jù)。動(dòng)物的血液生理生化指標(biāo)與年齡、性別相關(guān)[14],并呈現(xiàn)出一定的差異,對(duì)動(dòng)物的繁殖性能有一定影響。BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中常用的近交系小鼠,其生理生化指標(biāo)存在一定的差異性,與相關(guān)報(bào)道的研究結(jié)果[15]一致。小鼠成熟早、繁殖力強(qiáng),一般雌鼠30~50日齡、雄鼠45~60日齡性成熟[16],雌鼠 65~75日齡、雄鼠 70~80日齡體成熟[17],性成熟1個(gè)月后基本處于體成熟階段[18]。性別與性成熟、體成熟兩個(gè)生理階段的小鼠生理生化指標(biāo)的差異性為本研究探討的主要內(nèi)容,6周齡、9周齡的雌雄小鼠正好符合這一探討的條件。

        表3 6周齡和9周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠的血生化結(jié)果Table 3 Blood biochemical results of 6 weeks old and 9 weeks old SPF BALB/c mice

        表4 6周齡和9周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠的血生化結(jié)果Table 4 Blood biochemical results of 6 weeks old and 9 weeks old SPF C57BL/6 mice

        血液生理生化指標(biāo)不僅可以反映動(dòng)物的生理狀態(tài)和健康狀態(tài),還可以評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)性能和生產(chǎn)性能,對(duì)評(píng)價(jià)動(dòng)物的代謝狀況、生理狀態(tài)和飼養(yǎng)管理具有重要意義。本研究在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)條件下,采用同一儀器對(duì)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠的各項(xiàng)血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)與分析比較,檢測(cè)數(shù)據(jù)具有較好的參考價(jià)值。

        本研究SPF級(jí)BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠的血液生理生化指標(biāo)與王冬平等[4]所測(cè)定的結(jié)果有一定差異,可能原因是由于所用試劑、檢測(cè)方法等多種因素不同所致[19-20],但最主要的原因是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物級(jí)別和飼養(yǎng)環(huán)境的不同而造成差異。楊林等[11]對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠和C57小鼠血常規(guī)、主要臟器系數(shù)的比較結(jié)果反映了不同月齡小鼠的血常規(guī)指標(biāo)存在一定的差異性。本研究通過對(duì)相同生理階段雌雄BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測(cè),結(jié)果進(jìn)一步反映了在相同生理階段的雌雄小鼠血液生理指標(biāo)存在一定差異性;不同生理階段的同性小鼠血液生理指標(biāo)差異極顯著。同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn)在相同生理階段的雌雄小鼠血生化指標(biāo)差異不顯著,不同生理階段的同性別小鼠血液生化指標(biāo)差異極顯著,這與沙鼠[3]、兔[20]的血生化變化趨勢(shì)相似。

        通過對(duì)BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠血液生理指標(biāo)比較可發(fā)現(xiàn),RBC、HGB、HCT、PLT分別隨著生理狀態(tài)的成熟而增加,WBC反而減小。該生理現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于不同的生理階段,小鼠機(jī)體的激素水平、所需能量、耗氧量、免疫系統(tǒng)及功能等方面都有所變化,血常規(guī)檢驗(yàn)中紅細(xì)胞、白細(xì)胞以及血小板往往表現(xiàn)出不同程度變化[21];同時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種活性物質(zhì)維持血管的舒縮狀態(tài),調(diào)節(jié)器官血流的同時(shí)對(duì)血液凝固、白細(xì)胞活性及血小板聚集有重要作用[22]。在同一生理階段,RBC、HGB、HCT、PLT存在一定差異,可以看出近交系小鼠正常血液生理生化指標(biāo)在雌雄之間差異顯著,故在腫瘤學(xué)、藥效篩選等實(shí)驗(yàn)中注意動(dòng)物性別的選擇。WBC是機(jī)體防御的重要組成部分,LY更是在免疫反應(yīng)中起重要作用,在不同生理階段的小鼠WBC與LY數(shù)量均存在一定差異,說(shuō)明隨著生理階段的變化,小鼠的免疫機(jī)能逐漸增強(qiáng),故在免疫學(xué)、抗體制備等實(shí)驗(yàn)中注意動(dòng)物年齡和生理階段的選擇。

        血液生化指標(biāo)既能反映機(jī)體健康狀況,又能對(duì)疾病進(jìn)行診斷和監(jiān)測(cè)。ALB反映機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀況,TP由ALB和GLOB組成,能正常維持機(jī)體的膠體滲透壓,調(diào)節(jié)體內(nèi)物質(zhì)代謝及凝血等功能,本研究血清生化指標(biāo)中TP、ALB、BUN、TG、GLOB、A/G等指標(biāo)隨生理階段的變化均表現(xiàn)出差異性。TP[23]、ALB和GLOB水平較高可能與其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝改變有關(guān)。BUN是由肝臟合成的蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物,是體內(nèi)的一種代謝廢物,攝入的蛋白質(zhì)過多可導(dǎo)致BUN升高[24-25],同時(shí)日糧中蛋白質(zhì)的水平也會(huì)影響動(dòng)物母乳中的BUN含量[26-27]和對(duì)氮的利用率[28]。本試驗(yàn)中的BUN含量在小鼠正常范圍內(nèi)。CRE是血液中除蛋白質(zhì)以外的含氮物質(zhì),反映腎臟的排氮功能,因此通常用CRE與BUN聯(lián)合診斷腎功能異常疾病。ALP隨生理階段的變化呈現(xiàn)出顯著性差異,性成熟階段(6周齡)小鼠顯著高于體成熟(9周齡)小鼠,這種現(xiàn)象與人體內(nèi)ALP水平變化趨勢(shì)相似[29],這與肝功能的變化有關(guān)。GLU是在神經(jīng)、激素和肝臟等組織器官下調(diào)節(jié)保持相對(duì)恒定[30],與本研究中同一品系小鼠測(cè)定結(jié)果相似。

        4 結(jié)論

        本研究比較分析了不同生理階段和性別BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠的血液生理生化參數(shù),發(fā)現(xiàn)血液的生理生化值明顯受品系、性別和生理階段等因素的影響,這對(duì)進(jìn)一步研究疾病模型及其他相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),建議科研工作者在使用小鼠進(jìn)行相關(guān)研究時(shí),加強(qiáng)對(duì)小鼠品種、品系、性別及生理階段的選擇,同時(shí)加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物生理與健康狀況的監(jiān)測(cè)以及營(yíng)養(yǎng)水平與生活環(huán)境的控制。

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