孫 堯，孫 鑫，王 雷

（黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江 哈爾濱 150020）

【研究意義】在植物逆境脅迫應答過程中，轉錄因子通過與啟動子中的順式作用元件特異性結合，調控靶基因的表達，從而可以提升植物的抗逆性［1］。以往植物抗逆育種研究通常只針對單一基因進行，由于植物逆境脅迫應答是一個非常復雜的過程，需要大量基因協(xié)同參與，單一基因對植株抗逆性狀提升往往不明顯，因此植物抗逆育種研究需要從多基因、多性狀和多通路入手?！厩叭搜芯窟M展】AP2/ERF（APETALA 2/ethylene-responsive element binding factor）轉錄因子家族是植物最大的轉錄因子家族之一，根據(jù)結構域特征可以將AP2/ERF轉錄因子家族蛋白分為AP2、ERF、DREB、RAV亞家族。其中，RAV亞家族蛋白的特征是同時具有AP2和B3保守結構域，相比其他AP2/ERF轉錄因子亞家族，RAV家族成員數(shù)量較為有限，但已有研究表明RAV轉錄因子可以在乙烯［2］、油菜素內酯［3］和生物和非生物脅迫響應［4］過程中發(fā)揮重要作用。作為細胞膜的組成部分，膜脂通?？梢栽谛盘栟D導過程中發(fā)揮重要作用，而膜脂水解酶磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（phosphatidylinositolspecific phospholipase C，PI-PLC。以下簡稱PLC）家族蛋白是脂信號通路的重要成員，在植物中，PLC由EF手型結構域、X結構域、Y結構域和C2結構域組成，PLC通過對膜脂底物的水解以及相關代謝產(chǎn)物的合成，調控磷脂酰肌醇4,5二磷酸（PIP2）、三磷酸肌醇（IP3）、二酰甘油（DAG）、磷脂酸（PA）等信使類物質的含量以適應植物對生物脅迫及非生物脅迫的應答，其中OsPLC1參與介導鈣離子信號調控葉片鈉離子累積［5］；OsPLC4通過水解膜脂底物PI生成的小分子信使參與鈣離子和磷脂酸信號通路，進而提升水稻幼苗的耐鹽及耐旱性［6］；番茄PLC4和PLC6則被證實參與植物防衛(wèi)及免疫信號通路［7］。由此可見，PI-PLC所參與的細胞活動與RAV轉錄因子類似，但目前尚未有研究證實二者在相關信號通路中有直接關聯(lián)?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期對楊樹PI-PLC家族基因鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)了一個可編碼RAV和PLC結構域的特殊基因。【擬解決的關鍵問題】利用生物信息學分析工具，分析該基因編碼氨基酸的理化性質、保守結構域、磷酸化位點、亞細胞定位、信號肽、跨膜區(qū)、啟動子序列、蛋白質功能網(wǎng)絡、KEGG通路及三維結構，以期為該基因克隆及所參與信號通路分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 毛果楊RAV/PLC基因和蛋白序列的獲得

通過Phytozome數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!search?show=BLAST&method=Org_Ptrichocarpa）檢索“PLC”，查找并獲得毛果楊RAV/PLC基因序列（Potri. 018G109200）。

1.2 分析方法

將RAV/PLC基因序列輸入NCBI BLAST進 行 分 析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；利用ExPaSy的ProtParam軟件（https://web.expasy.org/protparam/）預測蛋白質分子量、理論等電點；通過Interpro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）進行蛋白保守區(qū)分析；使用Mega 7.0構建序列進化樹；通過NetPhos3.1預測其磷酸化位點［8］；利用 SignalP 3.0［9］預測其信號（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）； 采 用Plant-mPLoc［10-12］（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進行亞細胞定位預測；通過 TMHMM Server 2.0［13］（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和 TMpred［14］（https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）預測其跨膜區(qū)；利用 PlantCARE［15］（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析其啟動子序列；借助String軟件（https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=mWhORPeJ7Wtd&input_page_active_form=single_sequence）預測蛋白質功能網(wǎng)絡并通過KEGG Blast分析該蛋白生物學功能；利用 I-TASSER［16-18］（https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）進行同源建模預測三維結構。

2 結果與分析

2.1 RAV/PLC理化性質預測及結構域分析

在Phytozome中以“PLC”為關鍵字進行檢索Populus trichocarpav3.0數(shù)據(jù)庫，結果包含一個可編碼AP2結構域（45～107位氨基酸）、B3結構域（167～277位氨基酸）和PLC-X結構域（476～542位氨基酸）的基因（圖1A），登錄號為Potri. 0180G109200，根據(jù)結構特征將其命名為RAV/PLC基因。RAV/PLC基因定位于18號染色體，基因全長2 866 bp，其ORF區(qū)域長度為1 650 bp，編碼氨基酸549個，含有4個外顯子及3個內含子。ExPaSy的ProtParam預測結果表明，RAV/PLC編碼的氨基酸分子量為62.72338 ku；理論等電點為9.16；其分子式為C2771H4372N782O832S24，不穩(wěn)定系數(shù)為48.70，說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

NCBI Blast檢索確認RAV/PLC基因序列與 POP043-C12（GenBank：AC215840.1） 部 分序列比對完全一致，選取BLAST結果中得分較高序列構建序列進化樹，結果表明除Potri.0180G109200.1、Potri. 0180G109200.2兩個轉錄本外，RAV/PLC與XM_024590588.1的親緣關系較為接近（圖1B），這主要是由于該基因也含有PLC-X結構域的編碼序列，但XM_024590588.1在RAV結構域之后提前出現(xiàn)了終止密碼子，使得該基因ORF區(qū)并不包含PLC結構域。

圖1 RAV/PLC結構域預測及進化樹Fig. 1 Domain prediction and the constructed phylogenetic tree for RAV/PLC

Phytozome數(shù)據(jù)庫中RAV/PLC基因在楊樹中表達情況如圖2（彩插一）所示，該基因在楊樹芽、葉、根、莖中均有表達，在莖中整體表達量較高，芽中表達量次之，葉和根部相對表達量較少。

2.2 RAV/PLC信號肽、亞細胞定位、磷酸化位點、跨膜區(qū)預測

通過SignlP 3.0對RAV/PLC進行信號肽預測，結果表明RAV/PLC不含有信號肽。由于RAV轉錄因子家族與PLC家族蛋白行使功能不同，其定位位置通常存在差異，因此分別對RAV/PLC N端（1～300位氨基酸，包含RAV結構域）和C端（450～549位氨基酸，包含PLC-X結構域）進行亞細胞定位預測，預測結果表明，RAV/PLC N端定位于細胞核，而C端定位于細胞膜。通過NetPhos 3.1預測得到14個潛在的磷酸化位點，各位點信息如表1所示。通過TMHMM Server 2.0和TMpred預測其跨膜區(qū)并確認RAV/PLC N端、C端之間存在一個跨膜區(qū)（膜內到膜外），其中TMHMM Server 2.0預測跨膜區(qū)位于第455～477位氨基酸（圖3A中間區(qū)域，彩插一），TMpred預測跨膜區(qū)位于第455～483位氨基酸（圖3B分值高于500區(qū)域，彩插一）。

圖2 RAV/PLC在楊樹中表達情況熱圖Fig. 2 Heatmap displaying the expression patterns of RAV/PLC in poplar

圖3 RAV/PLC跨膜區(qū)預測結果Fig. 3 Transmembrane regions prediction results for RAV/PLC

圖4 RAV/PLC蛋白網(wǎng)絡和同源建模Fig. 4 Protein functional association networks and homology modeling for RAV/PLC

表1 RAV/PLC磷酸化位點預測結果Table 1 Prediction results of phosphorylation sites of RAV/PLC

2.3 RAV/PLC啟動子分析、蛋白質功能網(wǎng)絡預測

將RAV/PLC基因上游3 000 bp序列輸入PlantCARE進行順式元件預測，結果如表2所示。RAV/PLC基因啟動子中包含多個重要的順式作用元件，其中TATA-box為轉錄起始點上游-30～-50 bp核心啟動元件；CAAT-box是常見的轉錄效率調控元件；AE-box、I-box、Box 4、GATA-motif、MRE、GA-motif、TCT-motif均與光響應有關；GARE-motif、TGACG-motif、TCA-element分別與赤霉素、茉莉酸甲酯、水楊酸等植物激素應答相關；TC-rich repeats可以參與植物防衛(wèi)反應和脅迫應答；MBS順式元件與干旱誘導調控有關，同時MBS和MRE均為MYB轉錄因子的結合位點。以上結果表明，RAV/PLC基因表達可能受到上述條件誘導，并由MYB類轉錄因子直接參與調控。

將RAV/PLC氨基酸序列輸入String分析其蛋白質相互作用網(wǎng)絡，結果表明，RAV/PLC與String數(shù)據(jù)庫中POPTR_0018s11780.1蛋白序列有極高同源性，與RAV/PLC序列相比，POPTR_0018s11780.1缺失了第207～479位氨基酸。作用網(wǎng)絡預測結果表明，該蛋白可能與毛果楊 MYB103（POPTR_0006s12400.1）、WRKY49（POPTR_0006s08730.1，POPTR_0016s10610.1）、ABI5（POPTR_0006s08300.1）、DXS2（POPTR_0007s09490.1）存在功能關聯(lián)（圖4A，彩插一），RAV/PLC及網(wǎng)絡中蛋白GO（Gene ontology）功能注釋結果見表3，KEGG通路分析表明該基因符合RAV轉錄因子特征（KO entry :K09287），RAV/PLC可能與上述蛋白協(xié)同在相應途徑中發(fā)揮其生物學功能。

表2 RAV/PLC的PlantCARE預測結果Table 2 PlantCARE prediction results of RAV/PLC

2.4 同源建模

利用I-TASSER對RAV/PLC三維結構進行同源建模，其建模結果如圖4B（彩插一）所示。

表3 RAV/PLC蛋白網(wǎng)絡基因功能注釋Table 3 GO function annotations for RAV/PLC networks

3 討論

楊樹具有分布廣、適應性強、生長速度快的特點，是我國重要的造林和用材樹種，也是基因工程研究中的模式植物，篩選楊樹抗逆基因可以為優(yōu)良適應性樹種選育提供分子依據(jù)。在脅迫條件下，轉錄因子與順勢作用元件結合，啟動相關基因表達以提升植株對逆境的適應能力。與此同時，在感知逆境信號后，細胞膜可以通過脂信號向胞內進一步傳遞，以啟動下游相關代謝通路應答。RAV是AP2/ERF轉錄因子亞家族成員，研究表明RAV可以在植物激素處理和生物非生物脅迫應答過程中發(fā)揮作用，盡管已有大量研究探討楊樹AP2/ERF轉錄因子功能，但相比其他亞家族，RAV亞家族成員數(shù)量較少，對其在楊樹中的功能探討較為有限［19］。而PI-PLC作為脂信號的重要水解酶，其參與的細胞活動與RAV轉錄因子相似，但并未有文獻報道證實二者有直接關系。

本研究發(fā)現(xiàn)了一個可編碼PLC-X結構域、AP2結構域和B3結構域的基因RAV/PLC，Interpro確認其編碼氨基酸序列符合RAV轉錄因子和PLC-X催化結構域的特征，XM_024590588.1與RAV/PLC整體親緣關系較為接近，但該基因ORF區(qū)在RAV結構域后出現(xiàn)提前終止，因而并不包含PLC結構域。RAV/PLC基因表達在莖部最為顯著，在根部和葉部表達量相對有限。其編碼肽段不含信號肽，含有14個潛在的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點。對RAV/PLC N端（1～300位氨基酸包含RAV結構域）和C端（450～549位氨基酸包含PLC-X結構域）分別進行亞細胞定位預測，結果表明該肽段N端定位于細胞核，而C端定位于細胞膜。這一定位結果與RAV和PLC生物學功能相符合，一般轉錄因子定位在細胞核內發(fā)揮轉錄激活功能，而磷脂酶定位于細胞膜參與水解脂類底物。通過定位結果可以進一步推測，RAV結構域與PLC-X結構域之間可能存在一個跨膜區(qū)，TMHMM Server 2.0和TMpred均確認了這一跨膜區(qū)的存在，結合亞細胞定位可以預測RAV和PLC-X結構域分別位于核膜兩側，二者可能在特定條件下分別發(fā)揮其生物學功能。啟動子序列分析表明，RAV/PLC基因啟動子中包含TATA-box、CAAT-box等關鍵轉錄調控元件，同時包含光響應元件、植物激素應答元件、植物防衛(wèi)和脅迫應答以及干旱調控元件，部分元件可以同MYB轉錄因子特異性結合，以上結果表明RAV/PLC基因表達可能在上述特定條件下誘導發(fā)生并受MYB轉錄因子家族成員直接調控。通過String軟件分析RAV/PLC蛋白功能網(wǎng)絡，Blast結果表明RAV/PLC與POPTR_0018s11780.1具有較高的同源性，序列比對證明二者屬于不同轉錄本，與RAV/PLC相比POPTR_0018s11780.1缺失了第207～479位氨基酸，這一缺失包含了部分B3結構域和跨膜區(qū)序列，缺失部分可能與選擇性剪切調控有關，但缺失后其GO功能注釋結果并未受到影響。功能網(wǎng)絡表明該蛋白可能與MYB103、WRKY49、ABI5、DXS2存在功能關聯(lián)，RAV/PLC及其關聯(lián)蛋白GO功能注釋見表3，KO通路分析表明該基因與RAV信號通路相關。研究表明擬南芥MYB103基因在植物防衛(wèi)反應激發(fā)子幾丁質處理30 min后，其表達水平上調［20］；TaWRKY49可以通過水楊酸、茉莉酸、乙烯以及ROS介導信號，對小麥條銹菌抗性進行負調控［21］；ABI5是脫落酸介導的種子萌發(fā)及萌發(fā)后幼苗生長的關鍵調節(jié)子［22］，它通常與 ABI3協(xié)同作用［23］；在萜類生物合成反應MEP通路當中，DXS是前兩步反應所需的酶之一，它也在整個通路中發(fā)揮重要調控作用［24］。由此可見，蛋白網(wǎng)絡各成員功能與脅迫應答、激素響應有密切相關。同時利用I-TASSER獲得了RAV/PLC編碼蛋白的3D模型，對于RAV/PLC而言，絕大多數(shù)同源建模工具只會通過輸入序列比對情況對同源序列部分進行預測，因此在此類預測工具中，只有RAV結構域和PLC結構域的3D模型會生成。相比之下，I-TASSER則可以對RAV/PLC完整序列進行建模。

本研究所預測RAV/PLC生物學功能主要基于相關生物信息學分析手段，對于亞細胞定位、跨膜區(qū)等相關預測結果仍需要實驗驗證；啟動子序列中的核心調控元件仍需要進一步鑒定；基因表達模式、組織特異性表達規(guī)律、涉及的代謝通路等將是后續(xù)研究的主要內容。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)的RAV/PLC基因編碼氨基酸序列符合RAV轉錄因子和PLC催化活性區(qū)域的結構特征，通過生物信息學手段預測該序列N端定位于細胞核，C端定位于細胞膜，二者之間存在一個跨核膜區(qū)域。通過啟動子序列分析和蛋白質功能網(wǎng)絡預測RAV/PLC基因可能與光響應、植物激素、生物和非生物脅迫應答相關。本研究為該基因克隆及參與信號通路預測提供參考。