楊 婧,劉宇卓,劉青濤,趙冬敏,章麗嬌,黃欣梅,韓凱凱,李 銀

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部 獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014)

禽流感(Avian Influenza, AI)是由正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒屬A型流感病毒中任一亞型引起的家禽、野鳥和部分哺乳動物發(fā)病的一種傳染病[1-2]。高致病性禽流感會引起家禽高發(fā)病率及高死亡率,而低致病性禽流感則會導(dǎo)致家禽出現(xiàn)呼吸道癥狀、生長發(fā)育受阻及產(chǎn)蛋下降等,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[3]。根據(jù)A型流感病毒表面糖蛋白血凝素蛋白(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨基酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同,可將A型流感病毒分為不同的亞型,目前已發(fā)現(xiàn)有18種HA亞型和11種NA亞型,其中H17N10和H18N11僅在蝙蝠中分離鑒定[4-5]。根據(jù)致病性不同，又可將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感[6]。由H5和H7亞型毒株所引起的禽流感一般稱為高致病性禽流感(HPAI),其發(fā)病率和病死率都很高,危害極大[7-8],被OIE列為必須報(bào)告的動物傳染病,我國將其列為一類傳染病。而禽類中暴發(fā)的低致病性禽流感的亞型主要為H5N2、H9N2亞型。

H9N2亞型禽流感病毒呈世界性分布,按地區(qū)可分為北美和歐亞兩個種系[9]；我國分離的毒株多為歐亞種系,而A/Chicken/Heilongjiang/35/00則為北美種系[10]。我國于1994年首次從雞體內(nèi)分離出H9N2亞型禽流感病毒[11]。近些年我國每年均可分離到大量的H9亞型禽流感病毒,在臨床上被感染的雞常見蛋雞產(chǎn)蛋量下降、肉雞生長發(fā)育遲緩甚至死亡的現(xiàn)象；當(dāng)其與其它病原共感染時會導(dǎo)致高死亡率,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時H9亞型AIV可以感染人、豬等哺乳動物,因此對其進(jìn)行研究在公共衛(wèi)生上具有重要意義[12]。

實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行H9N2亞型禽流感病毒檢測時,一般先用血凝/血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行初篩,再用PCR方法進(jìn)行確診。在進(jìn)行PCR試驗(yàn)時,需要已知的H9N2病毒作為陽性參考,而有活性的H9N2病毒存在感染人類及散播病毒的危險(xiǎn),滅活的H9N2病毒又有保存條件的限制,普通的實(shí)驗(yàn)室不具備長期保存的資質(zhì),因此,需要構(gòu)建一個可以用于檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒,要求該質(zhì)粒在-20 ℃即可保存,使用方便,不會污染環(huán)境,不存在散播病毒的危險(xiǎn)。我們按照農(nóng)業(yè)部的NYT 772─2013標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建了487 bp長的HA檢測片段陽性質(zhì)粒,并對該質(zhì)粒的特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行了分析,以期獲得可用于檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒。

1 試驗(yàn)材料

H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所家禽與生物獸藥研究室家禽重大疫病防控項(xiàng)目組分離鑒定并保存。

PMD18-T、PMD20-T、反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、RNase Out、10 mmol/L dNTP、5×Buffer、10× PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2、聚合酶(E×Taq)均購自寶生物工程(大連)有限公司;E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程(大連)有限公司和南京諾維贊生物科技有限公司;0.22 μm微孔濾膜過濾器購自Millipore lreland Ltd.;生理鹽水(pH 6.8～7.0)、LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室自制;1%雞紅細(xì)胞溶液由本實(shí)驗(yàn)室自制,現(xiàn)用現(xiàn)配;瓊脂糖(BIOWEST AGAROSE G-10)購自Gene Company LTD公司; DL2000 DNA Marker購自DSBIO生物公司;氨芐青霉素、核酸染料購自上海蒲迪生物公司; RNA/DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自康寧生命科學(xué)有限公司;行標(biāo)特異引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，陽性質(zhì)粒的測序也由該公司完成。

本試驗(yàn)所用的儀器設(shè)備還有：超高速低溫離心機(jī)(Eppendorf)、水浴鍋(一恒科技)、Gradient PCR(Takala)、核酸凝膠電泳系統(tǒng)(南大普陽)、核酸凝膠成像系統(tǒng)(JS-680B)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(上海光都)、37 ℃搖床(華美生化)、高壓鍋(徐州圣業(yè)SY-450)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 H9N2病毒RNA的提取

將A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017樣品在無菌條件下取出200 μL，置于高壓滅菌后的1.5 mL離心管中,加入200 μL的V-L試劑后,用渦旋振蕩儀混勻,靜置5 min;加入75 μL V-N試劑,用渦旋振蕩儀混勻,以12000 g的轉(zhuǎn)速離心5 min;取上清加在新的2 mL離心管中,再加入300 μL異丙醇(含無水乙醇),上下倒置混勻,轉(zhuǎn)移至新的含有吸附柱的2 mL離心管中,以6000 g離心1 min;棄濾液,加入500 μL Buffer W1(含無水乙醇),以12000 g離心1 min;棄濾液,加入800 μL Buffer W2(含無水乙醇),以12000 g離心1 min;棄濾液,以12000 g離心1 min;將吸附柱置于新的1.5 mL離心管中,加入15 μL的TE試劑,靜置1 min,然后以12000 g離心1 min。此即為提取的H9N2亞型禽流感病毒RNA。

2.2 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄RT和PCR擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄體系為: RNA 12 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、5×Buffer 4 μL、Unit 12 1 μL、M-MLV 1 μL、RNase Out 0.5 μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?65 ℃ 5 min→42 ℃ 60 min→98 ℃ 5 min。

PCR擴(kuò)增體系為: cDNA 2.75 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10×Buffer 2.5 μL、ddH2O 14 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、E×Taq 0.25 μL、上游引物P1(5′-CTCCACACAGAGCAYAATGG-3′) 1 μL、下游引物P2 (5′-GYACACTTGTTGTTGTRTC-3′) 1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。

2.3 電泳和核酸膠純化

配制1%瓊脂糖凝膠,進(jìn)行電泳。調(diào)節(jié)電泳儀為穩(wěn)壓模式,在80 V下電泳30 min。將陽性條帶切下后,用膠回收試劑盒純化陽性條帶。

在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠,稱重后作為1個凝膠體積,加入3個凝膠體積的Buffer DE-A,混合均勻后于75 ℃加熱,每2～3 min混合1次,直至凝膠塊被完全熔化;加入0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B,混合均勻;將此混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2 mL離心管)中,以12000 g離心1 min,棄濾液;將制備管置回2 mL離心管中,加入500 μL Buffer W1(含無水乙醇),以12000 g離心30 s,棄濾液;將制備管置回2 mL離心管中,加入700 μL Buffer W2(含無水乙醇),以12000 g離心30 s,棄濾液;再加入700 μL Buffer W2(含無水乙醇),以12000 g離心1 min,棄濾液;將制備管置回2 mL離心管中,以12000 g離心1 min;將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中,在制備膜中央加25 μL ddH2O,在室溫下靜置1 min,以12000 g離心1 min洗脫DNA。

2.4 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的構(gòu)建和篩選

將膠回收的目的基因按照連接體系(10 μL): DNA 4 μL、pMD18-T Vector 1 μL、SolutionⅠ5 μL,在4 ℃下過夜連接,構(gòu)建HA檢測片段克隆載體。

從-70 ℃處取出E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,于手心迅速融化,然后置于冰上融化15 min,將10 μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中,并輕柔吹打混合均勻,立即冰浴30 min；然后迅速放入42 ℃水浴鍋中,熱激90 s,再立即冰浴5 min；結(jié)束后,每管內(nèi)加入900 μL SOC培養(yǎng)基,置于37 ℃恒溫?fù)u床,以120 g低速培養(yǎng)1 h，然后以4800 g離心5 min,吸取上清900 μL,在剩余培養(yǎng)基中將菌塊吹散均勻,并加入20 μL IPTG和40 μL X-Gal,混合均勻后,將菌液吸取滴加到含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中,用灼燒過的無菌玻璃棒將菌液涂布均勻；進(jìn)行標(biāo)記,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)12～16 h。

將37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜的LB固體培養(yǎng)基取出,用白槍頭挑取透明單菌落,每塊板子挑取7～10個單菌落,置于2 mL含0.1%氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫?fù)u床上以180 g培養(yǎng)10～12 h。對培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行PCR鑒定；電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察是否有陽性條帶,如有,則取500 μL菌液送金斯瑞(南京)生物科技有限公司進(jìn)行測序,測序完成后用DNAStar進(jìn)行序列分析。經(jīng)軟件比對后,將序列正確的菌液按1%擴(kuò)大培養(yǎng),在37 ℃恒溫?fù)u床上以180 g培養(yǎng)12～16 h后進(jìn)行質(zhì)粒提取。

質(zhì)粒提取方法如下:取1～4 mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液,以12000 g離心1 min,棄上清;加入250 μL Buffer S1(已加RNase A),充分懸浮細(xì)菌沉淀,確保菌液中無小菌塊;加入250 μL Buffer S2,上下輕柔翻轉(zhuǎn)4～6次以混合均勻,使菌體充分裂解形成透亮均一的溶液,此步驟不超過5 min;加入350 μL Buffer S3,上下輕柔翻轉(zhuǎn)4～6次以混合均勻、充分,再以12000 g離心10 min;吸取上清,轉(zhuǎn)移到DNA制備管中,以12000 g離心1 min,棄濾液;加500 μL Buffer W1,以12000 g離心1 min,棄濾液;加700 μL Buffer W2(含無水乙醇),以12000 g離心1 min,棄濾液;再次用700 μL Buffer W2(含無水乙醇)洗滌1次,以12000 g離心1 min,棄濾液;將制備管置回到2 mL EP管中,以12000 g離心1 min;將制備管置于潔凈的1.5 mL EP管中,在制備管膜中央加60～80 μL Eluent或去離子水,在室溫下靜置1 min，然后以12000 g離心1 min,充分洗脫質(zhì)粒；將質(zhì)粒DNA保存于-20 ℃。

2.5 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的特異性鑒定

以H5禽流感病毒(H5)、H7禽流感病毒(H7)、H9禽流感病毒(H9)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)特異性引物同時對HA檢測片段質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢驗(yàn)其特異性,對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2.6 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的敏感性鑒定

用雙蒸水對HA檢測片段質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋,得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍稀釋液,分別用H9行標(biāo)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢驗(yàn)其敏感性；對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2.7 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的重復(fù)性鑒定

用雙蒸水將HA檢測片段質(zhì)粒作100倍系列稀釋,用H9行標(biāo)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,做6個重復(fù),檢驗(yàn)其重復(fù)性；對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 H9N2病毒的RT-PCR

由電泳圖1可知, A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017在行標(biāo)特異引物擴(kuò)增下可得到487 bp長度的HA片段。

1:陰性對照;2: ddH2O;3: A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017;4: A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017;M:2000 bp Marker。

3.2 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的測序鑒定

對含HA檢測片段的陽性菌液用行標(biāo)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,將陽性條帶的菌液進(jìn)行測序,得到其序列(見圖2)；經(jīng)在線BLAST分析，其仍為H9N2禽流感病毒,且與原病毒的同源性達(dá)100%(圖3)。

圖2 HA檢測片段陽性菌液的測序結(jié)果

3.3 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的特異性鑒定

以H5、H7、H9、IBDV、NDV、IBV特異性引物同時對HA檢測片段陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以檢驗(yàn)其特異性,對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,結(jié)果如圖4所示,僅用H9特異性引物擴(kuò)增時出現(xiàn)陽性條帶,而用其余引物擴(kuò)增時均未出現(xiàn)陽性條帶。

圖3 HA檢測片段陽性菌液與原病毒HA片段的同源性比較

3.4 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的敏感性鑒定

用雙蒸水將HA檢測片段陽性質(zhì)粒作10倍系列稀釋,用H9行標(biāo)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢驗(yàn)其敏感性；對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,結(jié)果如圖5所示,對10-1、10-2、10-3、10-4倍稀釋液進(jìn)行擴(kuò)增時,均出現(xiàn)了陽性條帶。

3.5 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的重復(fù)性鑒定

用雙蒸水將HA檢測片段陽性質(zhì)粒作100倍系列稀釋,用H9行標(biāo)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,做6個重復(fù),檢驗(yàn)其重復(fù)性；對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,結(jié)果如圖6所示,6個重復(fù)均出現(xiàn)了陽性條帶。

1: H5特異性引物擴(kuò)增;2: H7特異性引物擴(kuò)增;3: H9特異性引物擴(kuò)增;4: IBDV特異性引物擴(kuò)增;5: NDV特異性引物擴(kuò)增;6: IBV特異性引物擴(kuò)增;7:2000 bp Marker。

圖4HA檢測片段陽性質(zhì)粒特異性鑒定結(jié)果

4 討論

在本研究中,參考農(nóng)業(yè)部NYT 772─2013標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)的H9特異引物可以擴(kuò)增出487 bp大小的條帶,該SOP適用于規(guī)范H9亞型禽流感RT-PCR檢測方法的操作,是檢測H9亞型禽流感的金標(biāo)準(zhǔn)；根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建相應(yīng)的檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒,通過對陽性菌液測序、NCBI在線BLAST分析、與原病毒HA片段進(jìn)行同源性比較等鑒定，確認(rèn)該陽性質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時,對該陽性質(zhì)粒的特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行分析后,可以證明該HA片段的陽性質(zhì)粒特異性較高，敏感性能達(dá)到10-4倍稀釋，重復(fù)性較穩(wěn)定,是可用于檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒。

1:10-1倍稀釋;2:10-2倍稀釋;3:10-3倍稀釋;4:10-4倍稀釋;5:10-5倍稀釋;6:2000 bp Marker;7:10-6倍稀釋;8:10-7倍稀釋;9:10-8倍稀釋;10:10-9倍稀釋;11:10-10倍稀釋。

圖5HA檢測片段陽性質(zhì)粒敏感性鑒定結(jié)果

1:重復(fù)1;2:重復(fù)2;3:重復(fù)3;4:重復(fù)4;5:重復(fù)5;6:重復(fù)6;7:2000 bp Marker。

禽流感的早期診斷對于控制疫情具有重要的意義。一般通過病禽的流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化可做出禽流感的初步判斷；但若需做出準(zhǔn)確診斷,則需要檢測禽流感病毒的抗原、基因或者分離鑒定病毒。目前對于禽流感的診斷主要通過檢測禽流感抗原,其檢測方法有[13]:血凝/血凝抑制試驗(yàn)(HA/HI)、抗原捕捉ELISA、熒光抗體和免疫酶組化法等。檢測禽流感基因的方法主要有: RT-PCR法和標(biāo)記核酸探針原位雜交法，以RT-PCR法較為敏感和特異,為WHO所推薦的方法之一。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了用于檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒,在-20 ℃下即可保存,使用方便,并且不會污染環(huán)境,不存在散播病毒的危險(xiǎn)。