肖玉菲，陳博雯，劉雄盛，覃玉鳳，晏 巢，劉海龍*

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院、國家林業(yè)局 中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室、廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜 336600)

澳洲茶樹(Melaleucaahemifolia)為桃金娘科(Myrtaceae)白千層屬(Melateuca)植物，俗稱互葉白千層，其枝葉中含有4-松油醇、桉葉素、α-松油烯等揮發(fā)性成分，長期以來作為香料植物在澳洲廣泛種植[1]，其中4-松油醇型澳洲茶樹油的價(jià)值最高，是公認(rèn)的優(yōu)良天然芳香劑、抗菌劑、防腐劑[2]。20世紀(jì)90年代初，由于人們認(rèn)識(shí)到茶樹油的重要商業(yè)價(jià)值，我國開始引進(jìn)互葉白千層，陸續(xù)在廣東、廣西、福建、海南、云南、貴州等地大面積種植[3]。目前，國際上對(duì)茶樹油的需求量極大，價(jià)格穩(wěn)定，而國內(nèi)市場的需求量也在不斷增長[4]。

澳洲茶樹的繁殖主要有種子繁殖、扦插繁殖和組培繁殖。澳洲茶樹種子小、發(fā)芽率低，繁殖較為困難[5]，且基因型復(fù)雜，生長變異大，精油含量和成分參差不齊，會(huì)大大降低精油的產(chǎn)量[6]；扦插繁殖多受母株和季節(jié)限制，繁殖系數(shù)較低，大大地限制了其推廣速度[7]；而組培繁殖可以快速獲得大量遺傳性狀一致的優(yōu)質(zhì)苗木，滿足大規(guī)模栽培生產(chǎn)的需要[8]。

目前，有關(guān)澳洲茶樹的研究主要集中在化學(xué)成分[9]、扦插繁殖[10]、組培快繁[11]和育苗栽培[12]、專用肥[13]方面，未見其營養(yǎng)器官形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)方面的報(bào)道。本研究從形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)角度研究澳洲茶樹組織培養(yǎng)過程中芽分化和根發(fā)生的過程，進(jìn)而揭示其生長特性，旨在為澳洲茶樹組培過程中影響因素的調(diào)控與優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)，從而對(duì)其快速繁殖和生產(chǎn)開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

澳洲茶樹組培材料來源于廣西林科院資源收集圃；組培繼代芽和根系發(fā)育的試驗(yàn)材料采自廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所組培研究室。2017年5月5日開始，選取生長均一、健壯的組培繼代單芽，于同一天接種于繼代培養(yǎng)基(改良MS+6BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.6～1.0 mg/L+糖30 g/L+瓊脂3.5 g/L)和生根培養(yǎng)基(1/2 B5+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+糖15 g/L+瓊脂3.5 g/L)上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。分別采集繼代增殖5、10、15、20、25、30 d的組培繼代芽，每次取5株生根培養(yǎng)3、5、7、9、11、13 d的生根組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 將采集的材料清洗干凈，接種于培養(yǎng)基后置于Motic數(shù)碼體式顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.2 解剖學(xué)觀察 將采集的材料用清水沖洗掉培養(yǎng)基，切取要觀察的部位，立即用FAA固定液(75%酒精∶甲醛∶冰醋酸=18∶1∶1)固定48 h以上，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用常?guī)石蠟切片法切片[14]，即經(jīng)酒精系列脫水后，用二甲苯進(jìn)行透明，在56～58 ℃石蠟中浸蠟，LEICA_EG1150包埋機(jī)包埋，LEICA_RM2235切片機(jī)切片(切片厚度為8～10 μm)，番紅-固綠雙重對(duì)染，中性樹膠封片，LEICA DM2500型數(shù)碼生物顯微鏡觀察、記錄并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲茶樹組培苗莖的解剖結(jié)構(gòu)

觀察其橫切面(圖1)，從外到內(nèi)分別為表皮(Ep)、皮層(Ct)和維管柱。表皮是近圓形、排列緊密的一層細(xì)胞；表皮內(nèi)層為一層排列不規(guī)則的皮層薄壁組織；維管柱包括維管束(Vb)和髓(Pt)，維管束呈束狀不規(guī)則輻射排列，被染成紅色，占莖部橫切面的比例較小，厚度約為50 μm；維管束中形成層細(xì)胞較小，細(xì)胞質(zhì)濃，染色較深，由排列緊密的分生細(xì)胞組成；維管束區(qū)域以內(nèi)為髓部，髓部細(xì)胞較大，且排列相對(duì)較為整齊。

2.2 澳洲茶樹組培苗根的解剖結(jié)構(gòu)

澳洲茶樹的根由外到內(nèi)分別由表皮、皮層和維管組織組成(圖2)。表皮(Ep)由1層薄壁細(xì)胞組成，排列較為緊密，細(xì)胞較小，表皮上無根毛；皮層(Ct)占據(jù)根的大部分比例，由8～10層細(xì)胞組成，細(xì)胞較大，為不規(guī)則排列的薄壁細(xì)胞，厚度約為180 μm；維管組織由初生木質(zhì)部(Px)和初生韌皮部(Pp)組成，初生木質(zhì)部在中心，呈不輻射狀分布，束數(shù)不一，根據(jù)根的粗細(xì)有5～9束不等，初生韌皮部在初生木質(zhì)部和內(nèi)皮層之間，呈環(huán)狀分布。

圖1 澳洲茶樹組培苗莖的解剖結(jié)構(gòu)

圖2 澳洲茶樹組培苗根的解剖結(jié)構(gòu)

2.3 澳洲茶樹離體培養(yǎng)中芽形成的形態(tài)學(xué)觀察

澳洲茶樹組培繼代芽增殖時(shí)，不形成愈傷組織，直接在葉腋處長出新的腋芽(圖3)。其單芽培養(yǎng)5 d后(圖3-A)，在部分葉腋處開始萌出芽苞(Bd)；培養(yǎng)10～15 d后(圖3-B、圖3-C)，葉腋處芽苞逐漸增多且增大；培養(yǎng)20 d后(圖3-D)，芽苞伸長并逐漸展開，25 d(圖3-E)后腋芽迅速伸長，并長出葉子；培養(yǎng)30 d后(圖3-F)，腋芽生長與原來的單芽無異，并開始逐漸分化形成二級(jí)腋芽(Slb)，形成簇狀叢芽。

2.4 澳洲茶樹離體培養(yǎng)中芽形成的解剖學(xué)觀察

澳洲茶樹組培繼代單芽在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，觀察其橫切面可知(圖4-A)，葉柄處莖表皮細(xì)胞開始恢復(fù)分生能力并不斷分裂；維管束細(xì)胞也有明顯的形態(tài)變化，腋芽發(fā)生處，維管束細(xì)胞層數(shù)逐漸增多，厚度達(dá)到85 μm，并向外層生長，逐漸突破皮層，形成腋芽生長點(diǎn)(Ap)。培養(yǎng)10～15 d后(圖4-B)，觀察其橫切面，維管束細(xì)胞逐漸分裂形成新的維管束，呈放射狀排列，表皮和皮層細(xì)胞逐漸分裂包圍新的維管束細(xì)胞；觀察其縱切面(圖4-D、圖4-E)，新形成的腋芽生長點(diǎn)逐漸發(fā)育、增大，內(nèi)部逐漸形成維管束，并在其葉柄基部連接的位置與莖的維管束相連接。培養(yǎng)20 d后(圖4-C)，腋芽的解剖結(jié)構(gòu)和主莖完全一樣，包含表皮、皮層、維管束和髓，但每部分結(jié)構(gòu)較主莖細(xì)，其中維管束最為明顯，厚度僅為40 μm。培養(yǎng)30 d后，觀察其縱切面發(fā)現(xiàn)(圖4-F)，葉原基開始逐漸發(fā)育形成葉片，腋芽內(nèi)多處芽原基再度分裂形成二級(jí)腋芽(Slb)，二級(jí)腋芽的維管束從一級(jí)腋芽的維管束發(fā)育分支而來。

圖3 澳洲茶樹芽形成的形態(tài)學(xué)觀察

圖4 澳洲茶樹芽形成的解剖學(xué)觀察

2.5 澳洲茶樹離體培養(yǎng)中根形成的形態(tài)學(xué)觀察

在離體培養(yǎng)生根過程中，澳洲茶樹組培苗表現(xiàn)出一系列形態(tài)變化。培養(yǎng)3 d時(shí)(圖5-A)，莖的基部在外觀上尚無明顯變化；培養(yǎng)5 d后(圖5-B)，莖的基部切口處及切口之上開始膨大，形成愈傷組織突起，顏色呈乳白色偏灰色，但無不定根產(chǎn)生；培養(yǎng)7 d后(圖5-C)，有少量根尖突破莖基部膨大組織，形成短粗狀的根；培養(yǎng)9 d后(圖5-D)，約有10條根突破莖基部膨大組織，根短粗，呈乳白色；培養(yǎng)11 d后(圖5-E)，根系數(shù)量逐漸增多、伸長，發(fā)達(dá)根系基本形成，不定根平均長3 cm左右；培養(yǎng)13 d后(圖5-F)，除伸長生長的主根外，在主根側(cè)部逐漸長出須根，根最終呈現(xiàn)為灰白色。此外，少量須根會(huì)由莖基部切口上端節(jié)的部位發(fā)出。

圖5 澳洲茶樹根形成的形態(tài)學(xué)觀察

2.6 澳洲茶樹離體培養(yǎng)中根形成的解剖學(xué)觀察

取接種在生根培養(yǎng)基上3 d的莖下部做切片可以觀察到(圖6-A)：維管組織較之前莖中維管組織厚，厚度約為110 μm，維管組織與皮層交界處開始產(chǎn)生與周圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯不同、染色較深、細(xì)胞密度較大的薄壁細(xì)胞，并有向外擴(kuò)張的趨勢。培養(yǎng)5 d后(圖6-B)，維管細(xì)胞從形成層位置向外加寬成多列細(xì)胞，形成排列緊密的與周圍細(xì)胞有明顯區(qū)別的圈狀薄壁細(xì)胞團(tuán)，這團(tuán)薄壁細(xì)胞繼續(xù)分化逐漸形成根原基(Rp)，隨著根原基的進(jìn)一步膨大，周圍細(xì)胞和維管束被擠壓并推到兩邊。培養(yǎng)7～11 d后(圖6-C～圖6-E)，根原基繼續(xù)向外生長，穿過皮層和愈傷組織，伸出表皮，初步形成橫切面近圓形的不定根(AR)。培養(yǎng)13 d后(圖6-F)，在已形成的不定根中再次發(fā)現(xiàn)根原基。

觀察其縱切面可見，在根的形成過程中，首先是內(nèi)皮層的維管細(xì)胞大量分裂生長(圖6-G)，形成排列緊密而整齊的薄壁細(xì)胞群，細(xì)胞質(zhì)濃，隨后薄壁細(xì)胞群不斷生長發(fā)育、分化，逐漸突破內(nèi)皮層后進(jìn)入皮層薄壁細(xì)胞，形成圓柱狀根原基(圖6-H)，在朝向表皮的一端的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)化為不定根的頂端分生組織，根原基前部細(xì)胞繼續(xù)分裂，逐漸形成生長點(diǎn)和根冠，生長點(diǎn)細(xì)胞繼續(xù)分裂、分化，突破其愈傷組織細(xì)胞，擠壓皮層細(xì)胞，使其破裂形成缺口，根原基內(nèi)細(xì)胞則在一定部位進(jìn)行旺盛分裂，推動(dòng)根原基不斷向外伸長，伸出表皮，形成外露的根，根尖后端的細(xì)胞不斷生長、分化，逐漸形成維管組織，并與最初莖的維管系統(tǒng)相連(圖6-I)。

3 結(jié)論與討論

3.1 芽器官的發(fā)生途徑

在植物組織培養(yǎng)中，植物芽器官的發(fā)生途徑通?？梢苑譃槠鞴匍g接發(fā)生途徑與器官直接發(fā)生途徑2種類型[15]。在器官間接發(fā)生途徑中，外植體在培養(yǎng)基中的植物生長物質(zhì)等因素的誘導(dǎo)下，其細(xì)胞經(jīng)脫分化形成由薄壁細(xì)胞所組成的愈傷組織，在適宜的植物生長物質(zhì)等培養(yǎng)條件下愈傷組織發(fā)生生理、生化上的改變，從而使細(xì)胞分裂的部位、方向發(fā)生改變，再分化出芽、根等器官；器官直接發(fā)生途徑是器官發(fā)生過程中缺少間接途徑所需的誘導(dǎo)愈傷組織階段，外植體直接分化出器官[16]。有研究報(bào)道通過愈傷組織分化形成不定芽的方式獲得再生植株，變異率較高，通過莖尖或分生組織培養(yǎng)增殖側(cè)芽可以保持基因型基本不變[17-19]。

圖6 澳洲茶樹根形成的解剖學(xué)觀察

在本研究的澳洲茶樹芽器官誘導(dǎo)過程中，不產(chǎn)生愈傷組織，在葉腋處直接發(fā)育形成芽，隨著腋芽不斷生長分化，腋芽的葉腋處分化出二級(jí)腋芽，最后形成簇狀的叢生芽。澳洲茶樹組培芽器官直接來源于其芽原基的誘導(dǎo)，芽器官再生方式為器官直接發(fā)生方式，以這種方式生成器官，可有效地保持其遺傳的穩(wěn)定性，對(duì)于其油分保持優(yōu)良品質(zhì)具有重要意義。

3.2 不定根的發(fā)生途徑

不定根原基按其形成時(shí)間和條件分為潛伏根原基和誘導(dǎo)根原基2種。潛伏根原基是在植株發(fā)育早期產(chǎn)生，處于休眠狀態(tài)，在適宜環(huán)境條件下可繼續(xù)發(fā)育形成不定根；誘導(dǎo)根原基是經(jīng)生根處理之后才形成的根原基[20]。澳洲茶樹單芽接種到生根培養(yǎng)基時(shí)，莖內(nèi)并沒有根原基，這種生根方式屬于誘導(dǎo)生根型。

不定根按其形成部位可分為皮部生根型(也稱直接發(fā)生)、愈傷組織生根型(也稱間接發(fā)生)和混合生根型[21]，愈傷組織生根是芽基部發(fā)生愈傷組織，從愈傷組織內(nèi)分化出根原基，再發(fā)育形成不定根；皮部生根是形成層或各部位的薄壁細(xì)胞脫分化，轉(zhuǎn)變?yōu)轭惙稚M織，分裂分化產(chǎn)生根原基，再分化發(fā)育形成不定根[22]。澳洲茶樹屬于皮部生根型，但研究發(fā)現(xiàn)，澳洲茶樹的不定根形成前先形成愈傷組織，從而誘導(dǎo)根原基產(chǎn)生。有研究報(bào)道在不定根形成的過程中，若沒有愈傷組織形成，只有莖的初生結(jié)構(gòu)，維管束與形成層交接處形成不了根原基，愈傷組織的存在，對(duì)根原基的產(chǎn)生有一定的刺激作用，通常都會(huì)先產(chǎn)生愈傷組織，這是因?yàn)槠淇砂l(fā)揮吸收和防御的功能，同時(shí)為后期不定根的生長提供營養(yǎng)。但愈傷組織一旦過分發(fā)達(dá)[23]，就會(huì)過多消耗莖內(nèi)的養(yǎng)分和生根物質(zhì)，使其老化，也不會(huì)有根原基的產(chǎn)生，導(dǎo)致不能生根[24]。本研究發(fā)現(xiàn)澳洲茶樹在不定根形成時(shí)，若形成的愈傷組織較小，組織培養(yǎng)瓶內(nèi)產(chǎn)生的根可多達(dá)十幾條，而一旦形成較大愈傷，便不能生根，這與上述結(jié)論一致。而愈傷組織的大小與激素濃度密切相關(guān)[25]，因此，澳洲茶樹進(jìn)行組培生根時(shí)，調(diào)節(jié)激素的濃度，選擇合適的激素配比，控制愈傷組織的大小，對(duì)提高其生根率至關(guān)重要。

有研究發(fā)現(xiàn)，莖段皮層的構(gòu)造對(duì)不定根的發(fā)生有一定影響[26]，如果皮層中存在環(huán)狀厚壁組織，則生根則較難，反之，生根則相對(duì)容易。澳洲茶樹皮層中并不存在厚壁組織，在合適的培養(yǎng)條件下7 d即可看到粗壯的根，屬于較易生根類型的樹種。

本研究對(duì)澳洲茶樹組培苗芽的增殖和不定根發(fā)育過程進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀察，為其器官形成和發(fā)育提供了理論依據(jù)，為提高澳洲茶樹增殖系數(shù)和生根率提供了一定的實(shí)踐指導(dǎo)，有利于組培增殖和生根過程中各種問題的解決。