劉 睿 孫 弦 胡 珍 吳 庭 曹育春 彭才智

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是一種好發(fā)于泌尿生殖器皮膚黏膜部位的增生性性傳播疾病，是由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起，常用治療包括CO2激光、液氮冷凍、光動(dòng)力、藥物等，但其治療后容易復(fù)發(fā)，是臨床中面臨的一大難題[1]。有研究表明，尖銳濕疣治療后復(fù)發(fā)的根本原因是HPV感染后營(yíng)造了局部免疫抑制的微環(huán)境，使其逃避了機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除，進(jìn)而引起尖銳濕疣的反復(fù)發(fā)作[2]。在人體皮膚黏膜抗HPV感染的免疫過(guò)程中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮了重要作用，它屬于一類髓性的自然免疫細(xì)胞，可通過(guò)吞噬病毒顆粒、釋放細(xì)胞因子等方式抑制病毒感染而產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)。在不同的局部微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞的功能表型可發(fā)生不同的極化，其中最常見(jiàn)的兩種極化形式為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞[3]。在腫瘤的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在腫瘤實(shí)體和間質(zhì)組織中有較多腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)，多表現(xiàn)為M2型巨噬細(xì)胞樣功能表型，可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展等，不利于腫瘤的預(yù)后[4]。臨床上尖銳濕疣皮損組織的生長(zhǎng)模式類似腫瘤組織，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)[5]，尖銳濕疣組織內(nèi)有較多的巨噬細(xì)胞，而不同表型的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況及其對(duì)尖銳濕疣復(fù)發(fā)的影響尚不清楚。本文通過(guò)檢測(cè)尖銳濕疣組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)+巨噬細(xì)胞(M1型)、CD163+巨噬細(xì)胞(M2型)的浸潤(rùn)情況，以探討其對(duì)尖銳濕疣免疫逃逸的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料 尖銳濕疣標(biāo)本取自武漢市第三醫(yī)院皮膚科2017年1月至2018年1月的30例門診患者，均經(jīng)組織病理確診為尖銳濕疣。其中男21例，女9例；年齡16～53歲，平均26.5歲；病程1～6個(gè)月。所有患者就診前1個(gè)月均未接受任何治療，均無(wú)其他皮膚病及系統(tǒng)免疫疾病。對(duì)照組15例正常皮膚組織來(lái)自色素痣整形手術(shù)切除后遺棄的正常皮膚組織。CA標(biāo)本和正常組織的獲取，均已得到患者的知情同意。

1.2 主要試劑 即用型鼠抗人CD163單克隆抗體、即用型鼠抗人iNOS單克隆抗體、即用型免疫組化Elivision-plus 試劑盒(鼠|兔)、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 標(biāo)本處理及免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本獲得后在10%中性福爾馬林溶液中固定24小時(shí)，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，行免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片脫蠟，水化，檸檬酸高壓修復(fù)抗原，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡觀察。用已知的陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 CD163、iNOS主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。首先低倍鏡(×100)觀察每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞密集區(qū)，然后每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，取平均值，15天后再用上述方法計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，兩次結(jié)果的平均值作為最后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)、Pearson線性相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M1/M2型巨噬細(xì)胞在尖銳濕疣和正常組織中浸潤(rùn)情況 iNOS+M1型巨噬細(xì)胞在CA皮損組織中數(shù)量為(6.16±3.32)/HP，正常組織中數(shù)量為(6.76±0.87)/HP(圖1)；CD163+M2型巨噬細(xì)胞在CA皮損組織中數(shù)量為(22.30±6.27)/HP，正常組織中數(shù)量為(9.81±4.23)/HP(圖2)。在CA皮損組織中，iNOS+M1型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)與正常組織相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而CD163+M2型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)與正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 iNOS+M1型巨噬細(xì)胞在CA組織(1a)和正常組織(1b)中的浸潤(rùn)(SP，×400)圖2 CD163+M2型巨噬細(xì)胞在CA組織(2a)和正常組織(2b)中的浸潤(rùn)(SP，×400)

2.2 M1/M2型巨噬細(xì)胞在尖銳濕疣組織浸潤(rùn)的相關(guān)性 在CA組織中，CD163+M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多的同時(shí)，iNOS+M1型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)減少，經(jīng)Pearson統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，二者呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.905，P<0.05)(圖3)。

圖3 iNOS+M1型和CD163+M2型巨噬細(xì)胞在CA組織中的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)(直線為計(jì)算出的回歸直線)

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體一類重要的髓性天然免疫細(xì)胞，主要通過(guò)吞噬作用及分泌細(xì)胞因子、致炎因子、活性氧化物等，參與機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫過(guò)程。巨噬細(xì)胞的可塑性和異質(zhì)性很強(qiáng)，效仿Th1/Th2細(xì)胞的分型方式，可將巨噬細(xì)胞極端的分為兩大類：經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞[6]。在微環(huán)境中干擾素(interferon，IFN)-γ)或/和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)的誘導(dǎo)刺激下，巨噬細(xì)胞可極化為經(jīng)典活化的M1型，其主要參與Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)，發(fā)揮針對(duì)胞內(nèi)微生物的免疫清除、抗腫瘤作用及宿主免疫功能等；而在微環(huán)境中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4、IL-13或IL-10、糖皮質(zhì)激素等的誘導(dǎo)刺激下，巨噬細(xì)胞可極化為選擇性活化的M2型，其在機(jī)體腫瘤生長(zhǎng)及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，參與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲，促進(jìn)血管、淋巴管生成以及抑制T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的免疫活性[6，7]。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)HLA-DR、iNOS等，而M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)清道夫(如CD163)、甘露糖(如CD206)等表面受體以及精氨酸酶(arginase，ARG)1，低表達(dá)iNOS酶[7，8]。其中，iNOS酶主要由M1型巨噬細(xì)胞合成分泌，催化L-精氨酸產(chǎn)生NO和L-瓜氨酸，NO參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、殺滅微生物及抗腫瘤過(guò)程，可作為M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物[8]。CD163屬于富含半胱氨酸的清道夫受體膜蛋白家族，主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞系的表面，可以結(jié)合血紅蛋白-珠蛋白復(fù)合物，從而將血紅蛋白攝入單核-巨噬細(xì)胞中參與代謝，多被用來(lái)標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞[8，9]。

本研究選用iNOS作為M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記，CD163作為M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，尖銳濕疣皮損組織中M1型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量較正常組織無(wú)明顯差異，而M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常組織，且M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明隨著M2型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增多，M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)隨之減少。該研究結(jié)果初步證實(shí)了尖銳濕疣皮損組織中有較多的M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，即M2型巨噬細(xì)胞在尖銳濕疣局部免疫中處于優(yōu)勢(shì)，結(jié)合M2型巨噬細(xì)胞具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用，故其可能在尖銳濕疣皮損組織局部免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。而對(duì)于尖銳濕疣組織中的巨噬細(xì)胞如何轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細(xì)胞的機(jī)制，目前還不完全清楚。已經(jīng)有研究證實(shí)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以影響巨噬細(xì)胞表型及功能的變化[10]，而尖銳濕疣皮損組織中存在較多的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[5]。故我們推測(cè)尖銳濕疣皮損中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與了巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過(guò)程，這需要進(jìn)一步研究去證實(shí)。