閉厚輝， 張興

欽州市第一人民醫(yī)院麻醉科(廣西欽州 535000)

帶狀皰疹后神經(jīng)痛(postherpetic neuralgia，PHN)是一類頑固性神經(jīng)病理性疼痛，其機(jī)制與外周神經(jīng)敏化及脊髓、脊髓上中樞敏化有關(guān)[1]，其中炎癥慢性誘導(dǎo)是導(dǎo)致脊髓中樞敏化的重要機(jī)制之一[2]，Seybold等[3]證實(shí)環(huán)氧化酶2(cyclo-oxygen-ase2，COX2)通過炎癥調(diào)控參與脊髓背角神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)，提示調(diào)控COX2可能是藥物治療PHN的潛在靶點(diǎn)。普瑞巴林是神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的類似物[4]，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)電壓依賴性鈣通道的Ⅰ型α2-δ亞基，減少鈣離子抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[5]。研究發(fā)現(xiàn)，普瑞巴林可以修復(fù)疼痛中樞敏化[6]，因而在治療PHN中效果佳、安全性高、無(wú)劑量依賴性[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，普瑞巴林可抑制糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠大腦中COX2等蛋白表達(dá)[8]，而Lim等[9]研究發(fā)現(xiàn)口服普瑞巴林易出現(xiàn)頭暈、嗜睡等不良反應(yīng)，鞘內(nèi)注射則可減少這些不良反應(yīng)，但普瑞巴林在鞘內(nèi)是否通過調(diào)控PHN脊髓COX2而產(chǎn)生療效與降低藥物不良反應(yīng)目前暫未見報(bào)道。因此，2016年3月至2017年1月，本研究通過建立PHN模型大鼠，在鞘內(nèi)泵注普瑞巴林治療后觀察模型大鼠行為學(xué)及其脊髓COX2表達(dá)變化，擬進(jìn)一步闡釋普瑞巴林治療PHN的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型制作 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有的大鼠實(shí)驗(yàn)干預(yù)與處理均執(zhí)行國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則。32只SPF級(jí)SD大鼠從廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買，4周齡，體質(zhì)量80～150 g，自由飲食和作息，合格證號(hào)為：SYXK 桂2014-003。使用SPSS 19.0的隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器將大鼠分為4組(n=8)：空白對(duì)照組(C組)、PHN組、鞘內(nèi)注射對(duì)照組(PHN-NS組)及鞘內(nèi)注射藥物組(PHN-pr組)。除C組外，其余各組均經(jīng)腹腔注射0.2 μg/g的樹脂毒素(將樹脂毒素溶解于新鮮配制的吐溫80、乙醇和生理鹽水混合液中，混合液中三者的比例依次為10%、10%、80%，樹脂毒素會(huì)濃度為40 μg/mL)復(fù)制PHN模型。PHN-pr組在疼痛閾值穩(wěn)定后經(jīng)鞘內(nèi)置管泵注600 μg/24 h的普瑞巴林，PHN-NS組則僅注射等體積的生理鹽水。

1.2 主要試劑與儀器 普瑞巴林(國(guó)藥準(zhǔn)字J20100101，輝瑞制藥) 、樹脂毒素(Adooq生物，美國(guó))、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒(碧云天，上海)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(碧云天，上海)、COX-2一抗(ab6665，英國(guó)Abcam)、兔抗鼠GAPDH(ab8245，英國(guó)Abcam)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)，SYBR? Premix Ex Taq(Takara，日本)。Von Frey纖維絲(UGO，意大利)、熱敏刺激儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛儀器有限公司)，BX40F4型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本)，AxioCam ERC5s成像系統(tǒng)(德國(guó)蔡司)，Roche Light Cycler 480 Ⅱ熒光PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)StepOneTM)，Image Lab系統(tǒng)下成像儀(Bid-Rad，美國(guó))。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)機(jī)械痛閾測(cè)量 用Von Frey測(cè)量機(jī)械痛閾值(MWT)，測(cè)量范圍為：0.07～15 g，首先選擇2.0 g纖維絲垂直刺激安靜狀態(tài)下的大鼠右側(cè)后爪內(nèi)側(cè)皮膚，逐漸增加力度使纖維絲彎曲成角，持續(xù)1.5 s，連續(xù)檢測(cè)3次，檢測(cè)間隔5 min以上使大鼠安靜，當(dāng)大鼠出現(xiàn)嘶吼、添足、甩尾及彈腿任一行為均記為該力度陽(yáng)性，然后選擇低于此力度的下一型號(hào)纖維絲繼續(xù)刺激，直到小力度纖維絲刺激陰性為止，若為陰性則選擇大于此強(qiáng)度的纖維絲直到出現(xiàn)陽(yáng)性。

1.4 ELSIA檢測(cè)IL-6、TNF-α濃度 在普瑞巴林鞘內(nèi)注射連續(xù)治療21 d后，用10%水合氯醛腹腔注射6 mg/kg的劑量麻醉各組大鼠，取脊髓L4～6節(jié)段冰浴環(huán)境下行超聲勻漿，離心后分別提取上清液，按照ELSIA試劑盒說明書進(jìn)行濃度檢測(cè)。

1.5 免疫組化檢測(cè)脊髓COX2 取脊髓L4～6節(jié)段組織石蠟包埋、連續(xù)切片后進(jìn)行抗原修復(fù)，用COX2一抗4 ℃孵育過夜，然后分別用兔抗IgG二抗和辣根過氧化物酶孵育、DAB顯色、蘇木素染核，封片。用Olympus顯微鏡觀察、顯微攝像儀拍片，使用Image-pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)切片平均光密度值。

1.6 Western blot檢測(cè)COX2 取脊髓L4～6節(jié)段用含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液RIP冰浴中超聲勻漿，12 000 r/min離心30 min后取上清液，BCA標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)定法總蛋白濃度，上樣緩沖液后沸水浴5 min，取40 μg總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠分離，40 V恒壓下進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉對(duì)其封閉2 h，TBST漂洗后加入COX2一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗37℃孵育2 h。TBST清洗后在Image Lab系統(tǒng)下進(jìn)行條帶掃描成像，并計(jì)算目的條帶灰度值，以GAPDH為上樣量的內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白/GAPDH條帶灰度值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 痛閾值檢測(cè)結(jié)果 與C組比較，第7天時(shí)，PHN模型的機(jī)械痛閾值穩(wěn)定；與PHN組比較，在第22天時(shí)，PHN-pr組的機(jī)械痛閾值顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而PHN-NS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

時(shí)間C組(n=8)PHN組(n=8)PHN-NS組(n=8)PHN-pr組(n=8)F值P值制模當(dāng)天14.1±1.214.3±2.014.2±2.314.4±2.50.4800.698第1天14.8±1.45.3±1.2?5.6±1.25.8±1.2?91.5000.000第3天14.2±0.92.7±0.4?4.4±0.8△3.6±1.0?△329.1100.000第7天14.6±1.22.6±0.6?2.8±0.42.8±0.8?367.0720.000第10天14.5±1.12.1±0.6?2.0±0.56.3±1.8?202.7270.000第14天14.7±1.62.0±0.5?1.8±0.4Δ8.2±2.7?△146.6860.000第18天14.0±1.72.2±0.4?1.9±0.39.5±1.7?△339.3170.000第22天14.4±1.21.9±0.3?1.9±0.410.7±1.6?△518.2030.000第28天14.3±1.72.5±0.4?2.0±0.510.5±2.0?△279.9680.000

*與C組比較P<0.05；△與PHN組比較P<0.05

2.2 ELSIA檢測(cè)結(jié)果 與C組比較，PHN組脊髓勻漿液IL-6和TNF-α濃度均顯著增加(P<0.05)。與PHN組比較，PHN-pr組脊髓勻漿液IL-6和TNF-α濃度顯著降低(P<0.05)，而PHN-NS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

項(xiàng)目C組(n=8)PHN組(n=8)PHN-NS組(n=8)PHN-pr組(n=8)F值P值TNF-α7.52±0.7316.18±0.49?15.36±0.528.41±0.35△645.9910IL-62.32±0.417.16±0.74?5.51±0.163.77±0.41△193.3080

*與C組比較P<0.05；△與PHN組比較P<0.05

2.3 免疫組化結(jié)果 COX2主要表達(dá)于細(xì)胞膜，在C組、PHN組、PHN-NS組和PHN-pr組平均光密度值分別為40.26±5.38、186.47±10.62、190.35±11.78和123.28±12.59(n=15)。與C組比較，PHN組COX2的平均光密度值顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與PHN組比較，PHN-NS組COX2的平均光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而PHN-pr組脊髓COX2平均光密度值則顯著性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果 C組、PHN組、PHN-NS組和PHN-pr組脊髓COX2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.73±0.35、3.52±0.15、3.21±0.45和2.30±0.17。與C組比較，PHN組脊髓COX2的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與PHN組比較，PHN-pr組脊髓COX2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而PHN-NS組則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

3 討論

普瑞巴林目前以膠囊和緩釋片兩組制劑為主，廣泛應(yīng)用于臨床疼痛治療，在PHN治療中取得了良好療效[10]。本研究通過將緩釋片制劑換算后通過微量泵持續(xù)泵注，與口服方式不同，鞘內(nèi)給藥可直接進(jìn)入腦脊液作用于神經(jīng)系統(tǒng)。數(shù)據(jù)結(jié)果提示，鞘內(nèi)持續(xù)泵注方式在給藥后第15天痛閾值開始穩(wěn)定，而在坐骨神經(jīng)分支損傷模型則用藥5 d后則達(dá)到50%痛閾值提升[11]，這可能與PHN疼痛較為頑固有關(guān)。普瑞巴林作為鈣通道α2-δ亞基調(diào)節(jié)劑，參與神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)[12]，同時(shí)參與脊神經(jīng)結(jié)扎模型血液循環(huán)中炎癥的調(diào)控[13]。在疼痛發(fā)生機(jī)制中，TNF-α浸潤(rùn)上調(diào)脊髓細(xì)胞免疫與炎癥[14]，激活施萬(wàn)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞[15]，促進(jìn)了外周和中樞敏化[16]。IL-6則被視為骨關(guān)節(jié)痛神經(jīng)功能的生物學(xué)標(biāo)記物[17]。臨床數(shù)據(jù)顯示，PHN病情與患者血清中的IL-6顯著性正相關(guān)，推測(cè)高水平的IL-6作為引起神經(jīng)損傷的一個(gè)重要因素，在PHN的致病過程中發(fā)揮著重要作用[18]。在L5分子神經(jīng)損傷模型中，在背根神經(jīng)節(jié)上L5表達(dá)增加，而使用TNF-α抑制劑后疼痛覺和IL-6均得到抑制，可能與IL-6的接受TNF-α的調(diào)控有關(guān)[19]。因此，本研究在鞘內(nèi)持續(xù)泵注普瑞巴林后有效地降低了脊髓勻漿液中TNF-α和IL-6的含量，提示普瑞巴林在調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣離子通道的同時(shí)進(jìn)行了PHN模型脊髓的抗炎調(diào)節(jié)。

A:C組；B:PHN組；C:PHN-NS組；D:PHN-pr組；箭頭所指為COX2陽(yáng)性細(xì)胞

圖2 各組COX2蛋白表達(dá)條帶情況

COX2是非甾體抗炎免疫藥的常用選擇靶點(diǎn)，各組鎮(zhèn)痛方式可通過抑制其表達(dá)達(dá)到解熱鎮(zhèn)痛等功效[20]。在前列腺炎導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛中，COX2在前列腺和模型大鼠脊髓的后角均顯著增加，推測(cè)其參與了前列腺炎神經(jīng)病理性疼痛的形成和維持[21]，而COX2在脊髓的表達(dá)增加可能與TNF-α表達(dá)上調(diào)有關(guān)[22]，同時(shí)COX2的持續(xù)表達(dá)啟動(dòng)了疼痛模型脊髓中的炎性反應(yīng)[23]，參與誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)[24]，因此，盡管普瑞巴林不屬于非甾體抗炎藥，但本研究結(jié)果推測(cè)普瑞巴林在PHN中發(fā)揮調(diào)控抗炎效果，可能是與其介導(dǎo)脊髓COX2的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究首次報(bào)道鞘內(nèi)持續(xù)泵注普瑞巴林可有效改善PHN模型大鼠疼痛狀態(tài)可能與其通過下調(diào)脊髓L4～6節(jié)段COX2表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)脊髓神經(jīng)炎癥TNF-α和IL-6浸潤(rùn)有關(guān)。但本研究未使用COX2基因敲除鼠觀察鞘內(nèi)持續(xù)泵注普瑞巴林后的療效，仍需要繼續(xù)完善研究。