徐蕾，楊愛霞，肖衛(wèi)紅

(1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院，武漢 430065；2.武漢市第一醫(yī)院藥學部，武漢 430022)

高烏甲素(lappaconitine，LA)是從毛茛科植物高烏頭根中提取的難溶性二萜類生物堿，具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎效果，應用前景較廣泛。但高烏甲素水溶性極差，半衰期短，治療窗窄[1]，血藥濃度存在峰谷現(xiàn)象，對黏膜有較強刺激性，注射時易引起局部不適[2]，普通劑型難以克服這些缺陷。經(jīng)皮給藥脂質體具有生物相容性、緩釋性、增溶等特點[3]，是近年來研究的熱點。筆者在本實驗以脂質體為載體制備高烏甲素脂質體，并比較高烏甲素脂質體凝膠與高烏甲素凝膠給藥效果。

1 材料與方法

1.1試劑 高烏甲素原料(上海三新研究所，批號：20161006，含量：98.6%)；無水乙醇(天津市風船化學試劑科技有限公司，含量>95%，批號：201403)；膽固醇(上海山浦化工有限公司，含量：95%，批號：201404)；卵磷脂(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20170401，含量≥99%)；卡波姆(山東優(yōu)索化工科技有限公司，批號：16040605)；三乙醇胺(天津市風船化學試劑科技有限公司，含量：85.0%，批號：201206)；甲醇(西隴科學股份有限公司，含量≥99.5%，批號：201611)；甲醛(湖北奧生新材料科技有限公司，含量：37.0%～40.0%，批號：110908)；純化水為自制三蒸水。大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：AKOO17DECO4016)、白細胞介素2(IL-2)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：AKOO17DECO4017)。弗氏完全佐劑 (美國Sigma公司，批號：1002431819)。

1.2儀器 BS124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，感量：1 mg)；pH酸度計(上海儀電科學儀器)；MK3型酶標儀(熱電上海儀器有限公司)。

1.3實驗動物 昆明種(KM)小鼠，實驗動物合格證號：42000600025229，42000600025518；Wistar大鼠，實驗動物合格證號：42000600025813；日本大耳白兔，實驗動物合格證號：42000600025722。均由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物許可證號：00264380。

1.4試藥的制備

1.4.1高烏甲素脂質體的制備 精密稱取高烏甲素36 mg，卵磷脂320 mg，膽固醇40 mg，置于茄形瓶，加入二氯甲烷(CH2Cl2)10 mL超聲溶解，旋蒸去除溶劑(23 ℃，140 r·min-1)，使其在瓶壁形成均勻透明薄膜[4]；10 mL、55 ℃、pH值7磷酸鹽緩沖液(PBS)旋轉洗膜，攪拌水化3 h，水浴恒溫55 ℃，得脂質體粗品后超聲震蕩約3 min，即得，4 ℃冰箱保存。

1.4.2脂質體凝膠的制備 稱取0.18 g卡波姆940，將其均勻分散于8 mL純化水中溶脹過夜，得基質，三乙醇胺調節(jié)pH值至6.5～6.8。將高烏甲素脂質體10 mL與基質混合均勻，即得到卡波姆940含量為1.0%的粘稠高烏甲素脂質體凝膠，4 ℃冷藏保存。

1.4.3高烏甲素凝膠的制備 將0.18 g卡波姆均勻撒于10 mL純化水上，同“1.4.2”項法制備凝膠，將高烏甲素36 mg用乙醇2 mL溶解，加純化水至18 mL，充分攪拌。

1.4.4空白凝膠的制備 將0.18 g卡波姆均勻撒于10 mL純化水上，溶脹過夜，調節(jié)pH值至6.5～6.8即得。

1.5實驗原理及方法

1.5.1熱板實驗 高烏甲素通過抑制電壓依賴性Na+-Ca2+通道，抑制突觸前膜對去甲腎上腺素(NA)和5-羥色胺(5-HT)的再攝取，增加兩者在突觸間隙含量，抑制傳入神經(jīng)纖維P物質釋放[5]，發(fā)揮阻礙中樞神經(jīng)系統(tǒng)電信號傳導作用，從而實現(xiàn)鎮(zhèn)痛效果。小鼠熱板實驗可從中樞神經(jīng)方面考察高烏甲素脂質體凝膠作用效果[6]。

取KM雄性小鼠30只，體質量(20±2) g。實驗室溫度 20～24 ℃，相對濕度 40%～70%[7]。將小鼠置于(55.0±0.5) ℃熱板測痛儀上，記錄自放入至小鼠舔后足所需時間(s)，計為該鼠給藥前基礎痛閾值[8]。篩選出30 s內舔足小鼠，隨機分為3組：空白對照組、高烏甲素脂質體凝膠組和高烏甲素凝膠組，8%硫化鈉溶液腹部脫毛6 cm2，給藥前再測1次痛閾值，取2次痛閾平均值作為給藥前痛閾值。分別將空白凝膠、高烏甲素脂質體凝膠及高烏甲素凝膠0.15 mL涂于腹部，用藥后0.5，1，2，4 h測定痛閾。

1.5.2扭體實驗 高烏甲素能通過抑制腦導水管周圍灰質和皮質細胞Ca2+內流以及核因子κB表達，發(fā)揮周圍鎮(zhèn)痛作用[9]。筆者在本實驗以小鼠扭體實驗從周圍神經(jīng)方面考察高烏甲素脂質體凝膠作用效果。

取KM雄性小鼠30只，同“1.5.1”項飼養(yǎng)條件，隨機分為3組，即空白對照組、高烏甲素脂質體凝膠組和高烏甲素凝膠組。腹部硫化鈉脫毛，分別涂藥品，藥物與劑量同“1.5.1”項。連續(xù)5 d。第5天用藥后1 h，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL，以引起扭體反應(腹部內凹，臀部高起)，測定給藥后10，15 min內小鼠扭體次數(shù)。

1.5.3大鼠抗炎實驗 有研究表明，高烏甲素對甲醛、佐劑、二甲苯等炎癥模型有良好的的治療效果[10-11]。大鼠佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA) 模型為滅活的結核分枝桿菌誘導的T細胞介導的免疫亢進性炎癥模型[12-13]，AA大鼠模型是成熟模型，也是研究類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)常用模型。RA發(fā)病過程與多種細胞因子有關，如非酶促因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等[14-15]。RA患者體內TNF-α、IL-2水平上調，刺激內皮細胞產(chǎn)生黏附分子，黏附分子與白細胞作用，導致炎癥反應更強烈，且刺激纖維母細胞增殖[16]，影響生成骨細胞所需蛋白，從而破壞骨組織。降低TNF-α能減緩對軟骨的破壞[17]。筆者在本實驗通過大鼠AA實驗考察高烏甲素脂質體凝膠抗炎效果。

取SPF 級Wistar雄性大鼠30只，體質量約200 g，在(24±2)℃、光照周期12 h環(huán)境適應性飼養(yǎng)1周。每只大鼠右后肢踝關節(jié)周圍以記號筆做出環(huán)形標記，致炎前1 d用手術線繞足圍一周測量足周長。每只大鼠右后足趾皮內注射弗氏完全佐劑0.1 mL以制備AA大鼠。第14天再次測量足圍，與致炎前比較，增加0.5 cm即造模成功。將造模成功的大鼠以隨機數(shù)字表法分為模型對照組、高烏甲素脂質體凝膠組、高烏甲素凝膠組。模型對照組大鼠右后足趾均勻涂布空白凝膠0.25 mL，其他兩組分別涂布高烏甲素脂質體凝膠和高烏甲素凝膠0.25 mL，早晚各1次，均給藥1周。

1.5.4皮膚刺激性實驗 取健康白兔8只，體質量2.0～2.5 kg，眼科手術剪背部對稱脫毛2塊，每塊面積為5 cm×5 cm。分為完整皮膚組與破損皮膚組。破損皮膚組右側用#400細砂紙在脫毛部位制備擦傷，使皮膚出現(xiàn)密集出血點。每只白兔左側作為空白對照涂抹空白凝膠，完整皮膚組與破損皮膚組右測涂抹高烏甲素脂質體凝膠2.5 mL，24 h內涂藥兩次，涂完敷保鮮膜，膠帶固定，24 h后洗去殘留藥物。

1.6觀察指標與觀察方法

1.6.1觀察指標 體征：觀察大鼠致炎后毛發(fā)、行為、足腫脹等變化；足圍：致炎后每3～4 d同一時間、地點測量大鼠足圍。治療給藥當天記錄未給藥時大鼠右后足周長，以后每隔2 d測量右后足周長，取第1，3，5，7天數(shù)據(jù)結果。生化指標：給藥第7天禁食16 h，第8天經(jīng)眼眶取血分離血清，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定TNF-α、IL-2含量[16，18]。病理切片：麻醉后處死大鼠，剪下右后足炎性踝關節(jié)，小心剝離皮膚、肌肉組織，保留完整關節(jié)部分。甲醛固定，不同濃度梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋、切片(厚度4～7 μm)、進行蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察組織病理變化[19-20]。

1.6.2皮膚刺激性評價標準 觀察兔皮膚在洗去藥物后1，24，48 h至第7天皮膚反應，按照表1進行評分。

表1兔皮膚刺激性實驗評價標準

Tab.1Evaluationcriteriaforskinirritationtestinrabbits

紅斑分值平均分值評價無紅斑00.0～0.49無刺激極少數(shù)紅斑10.5～2.99輕度刺激中度紅斑23.0～5.99中度刺激大面積紅斑36.0～8.0嚴重刺激紫紅色紅斑并形成焦痂4

2 結果

2.1熱板實驗 見表2。給藥前，3組小鼠痛閾值差異無統(tǒng)計學意義；高烏甲素凝膠組和高烏甲素脂質體凝膠組2，4 h痛閾值均大于同時間點空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；高烏甲素脂質體凝膠組2，4 h痛閾值大于高烏甲素凝膠組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；給藥后0.5 h，3組差異無統(tǒng)計學意義；給藥后1 h，高烏甲素凝膠組和高烏甲素脂質體凝膠組高于空白對照組，高烏甲素凝膠組和高烏甲素脂質體凝膠組差異無統(tǒng)計學意義；給藥后2，4 h，高烏甲素凝膠組與高烏甲素脂質體凝膠組痛閾分別提高34.3%和125.8%。由表2可知，隨著給藥時間延長，高烏甲素脂質體凝膠組痛閾值明顯延長且明顯大于高烏甲素凝膠組，提示脂質體凝膠有緩釋作用。

2.2扭體實驗 與空白對照組比較，給藥后10，15 min，高烏甲素凝膠組、高烏甲素脂質體凝膠組扭體次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。給藥后10 min內，高烏甲素凝膠組扭體次數(shù)少于高烏甲素脂質體凝膠組，差異無統(tǒng)計學意義；給藥后15 min內，高烏甲素脂質體凝膠組扭體次數(shù)少于高烏甲素凝膠組，差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.3抗炎實驗

2.3.1大鼠表現(xiàn) 致炎第2天，大鼠右后足掌整體明顯紅腫，足趾腫脹，足圍及足厚度明顯增加。見圖1。致炎期間大鼠毛發(fā)光澤度差，行走輕微障礙，舔足次數(shù)增多。

2.3.2足圍造模期間足圍變化 見表4，給藥前各組足圍無明顯差別。與造模前比較，造模第14天足圍均增加>0.5 cm(P<0.01)，提示造模成功。給藥后每2～3 d測量足圍，結果見表5。與模型對照組比較，高烏甲素凝膠組與高烏甲素脂質體凝膠組足圍有變小趨勢，且在第4天，高烏甲素脂質體凝膠組足圍較模型對照組明顯變小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥第7天，與模型對照組比較，高烏甲素凝膠組與高烏甲素脂質體凝膠組均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且高烏甲素脂質體凝膠組足圍小于高烏甲素凝膠組(P<0.01)。

2.3.3血清生化指標 ELISA法測得標準曲線值，經(jīng)軟件計算得到TNF-α：Y=0.000 2X+0.011 0，r=0.996 1；IL-2：Y=0.000 7X+0.004 1，r=0.994 2，酶標儀測得吸光度值(A)值，代入公式后得到血清中大鼠TNF-α、IL-2濃度(pg·mL-1)，結果見表6。造模21 d后高烏甲素凝膠組與高烏甲素脂質體凝膠組TNF-α、IL-2濃度較模型對照組下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與高烏甲素凝膠組比較，高烏甲素脂質體凝膠組TNF-α與IL-2濃度顯著降低(P<0.05)。

表23組大鼠熱板實驗給藥前后痛閾值測定結果

Tab.2Resultsofpainthresholdbyhotplatetestinthreegroupsofratsbeforeandafteradministration

組別給藥前痛閾給藥后0.5 h給藥后1 h給藥后2 h給藥后4 h空白對照組22.90±5.3228.90±7.0623.80±4.3727.00±7.0927.30±6.96高烏甲素凝膠組22.56±5.6025.44±4.3631.33±6.65*128.11±6.81*136.67±11.74* 1高烏甲素脂質體凝膠組21.09±3.9127.64±7.2029.64±8.30*138.73±15.45*1*261.64±28.34*3*4

與空白對照組比較，*1P<0.05，*3P<0.01；與高烏甲素凝膠組比較，*2P<0.05，*4P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.05,*3P<0.01；Compared with lappaconitine gel group,*2P<0.05,*4P<0.01

表33組小鼠給藥前后扭體次數(shù)測定結果

Tab.3Resultsofwrithingtimesinthreegroupsofmicebeforeandafteradministration

組別10 min內扭體次數(shù)15 min內扭體次數(shù)空白對照組22.00±8.4939.6±13.0高烏甲素凝膠組9.54±9.43*121.0±16.2*2高烏甲素脂質體凝膠組11.70±9.01*218.0±13.6*1

與空白對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with blank control group,*1P<0.01,*2P<0.05

2.3.4踝關節(jié)病理切片 見圖2。放大相同倍數(shù)，可見模型對照組切片關節(jié)腔狹窄，滑膜組織增生、充血且伴有大量炎細胞浸潤，結締組織增生，出現(xiàn)較多血管翳，軟骨破壞明顯。與模型對照組與高烏甲素凝膠組比較，高烏甲素脂質體凝膠組關節(jié)腔較寬，結締組織排列較規(guī)則，炎細胞浸潤減輕。提示高烏甲素脂質體凝膠抗炎效果更好。

2.4家兔皮膚刺激實驗 按照評分標準，皮膚給藥后1～7 d，兔完整與破損皮膚評分為0，均未出現(xiàn)刺激紅腫現(xiàn)象。

3 討論

小鼠熱板實驗中，2 h后高烏甲素脂質體凝膠組痛閾值較高烏甲素凝膠顯著提高；扭體實驗中高烏甲素凝膠組與高烏甲素脂質體凝膠組差異無統(tǒng)計學意義；佐劑實驗發(fā)現(xiàn)，高烏甲素脂質體凝膠能顯著降低血清TNF-α、IL-2含量。以上實驗證明，在同等劑量下，隨著給藥時間的延長，高烏甲素脂質體凝膠鎮(zhèn)痛抗炎效果明顯強于高烏甲素凝膠，且脂質體可滯留于皮膚，增加藥物在皮膚中的含量，從而形成釋藥儲庫，使高烏甲素脂質體達到緩釋效果。以兔完整與破損皮膚刺激實驗對高烏甲素脂質體凝膠進行安全性評價，顯示該藥溫和無刺激。

圖1大鼠致炎后(A)與致炎前(B)足部對比圖

Fig.1Comparisonofthetoesofratsbefore(B)andafter(A)inducinginflammatory

實驗過程中應注意，卡波姆放置時長鏈舒展引起pH值下降，使用時需測定pH值并用三乙醇胺調節(jié)pH值為6.5～6.8。小鼠用硫化鈉脫毛后，需用0.9%氯化鈉溶液清洗皮膚并恢復1 d再給藥，防止對皮膚造成的損傷影響藥物吸收。涂抹藥物過程中小鼠易舔食藥物，因此應待藥物充分吸收后再放入飼養(yǎng)箱，大鼠足部抹藥時用紗布與醫(yī)用膠布包裹，以免其舔食。

本實驗證實，高烏甲素脂質體凝膠有一定療效且有緩釋效果，但其體內分布及代謝情況需進一步研究。

表43組大鼠造模期間足圍變化

組別造模前造模第4天造模第7天造模第10天造模第14天模型對照組2.191±0.0852.762±0.1372.808±0.0982.771±0.0732.825±0.080高烏甲素凝膠組2.188±0.0562.841±0.1912.919±0.1822.778±0.0832.787±0.099高烏甲素脂質體凝膠組2.193±0.0542.822±0.3352.859±0.1222.865±0.1252.819±0.094

表53組大鼠給藥前后足圍變化

組別給藥前給藥后第2天給藥后第4天給藥后第7天模型對照組2.825±0.0802.752±0.0452.734±0.0272.774±0.047高烏甲素凝膠組2.787±0.0992.722±0.1112.670±0.1002.638±0.091*1高烏甲素脂質體凝膠組2.819±0.0942.703±0.0682.645±0.041*22.554±0.042*1*3

與模型對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05；與高烏甲素凝膠組比較，*3P<0.01

Compared with model control group,*1P<0.01,*2P<0.05; Compared with lappaconitine gel group,*3P<0.01

表63組大鼠血清TNF-α和IL-2測定結果

Tab.6DeterminationofserumTNF-αandIL-2inthreegroupsofrats

組別TNF-αIL-2模型對照組234.64±28.4436.01±4.67高烏甲素凝膠組187.34±23.92*131.80±4.34*1高烏甲素脂質體凝膠組156.07±16.28*2*327.89±2.91*2*3

與模型對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與高烏甲素凝膠組比較，*3P<0.05

Compared with model control group,*1P<0.05,*2P<0.01; Compared with lappaconitine gel group,*3P<0.05

圖2 3組大鼠踝關節(jié)病理特征(HE，×200)

Fig.2Pathologyofanklejointinthreegroupsofrat(HE，×200)

佐劑關節(jié)實驗證實，高烏甲素能下調TNF-α、IL-2，從而發(fā)揮抗炎效果，這為研究高烏甲素抗炎作用機制提供了基礎。脂質體凝膠劑為近年研究的熱點，能提高藥物局部濃度，增加藥物的穩(wěn)定性，改善患者順應性，受到研究者青睞。本實驗結果可為高烏甲素脂質體制劑的開發(fā)提供新思路。