程金波 熊加川 綜述 趙景宏 審校

足細(xì)胞作為終末分化的上皮細(xì)胞，是腎小球濾過屏障的重要組成，通過其獨特的細(xì)胞足突與多孔濾膜結(jié)構(gòu)，在原尿的生成中起重要作用。因其在腎小球微環(huán)境中獨特的分布位置及功能，足細(xì)胞容易與通過濾過屏障血流中所攜帶的各種抗原相接觸，如細(xì)菌、病毒、毒素及炎癥因子等，因此足細(xì)胞有可能演化出類似抗原呈遞效應(yīng)的反應(yīng)機(jī)制并扮演類似固有免疫細(xì)胞。如樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞功能的角色。已有的研究證實了這種可能[1]，同時利用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA4)的胞外細(xì)胞域或人IgG1重鏈恒定區(qū)構(gòu)建的重組融合蛋白(CTLA4-Ig)特異性地阻斷B7-1表達(dá)可阻斷足細(xì)胞自身的抗原呈遞途徑，并有可能使部分以蛋白尿為表現(xiàn)的足細(xì)胞疾病患者受益[2]。但圍繞著足細(xì)胞是否可特異性地阻斷B7-1及CTLA4-Ig在腎臟病臨床應(yīng)用爭議不休，因此在下一步研究中，能否尋找到高重復(fù)性檢測足細(xì)胞特異性表達(dá)B7-1的方法將是至關(guān)重要的一步[3]。

B7-1抗原呈遞及CTLA4-Ig

抗原呈遞是機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)行免疫識別、應(yīng)答及效應(yīng)調(diào)控的重要生理過程。機(jī)體免疫系統(tǒng)在對抗原的攝取、加工及處理并形成抗原肽的同時，包括樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及活化的B 細(xì)胞等在內(nèi)的專職抗原呈遞細(xì)胞會同時表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)和協(xié)同刺激分子B7家族蛋白，如B7-1(又稱CD80)、B7-2(又稱CD86)等，與輔助T細(xì)胞(Th細(xì)胞)受體CD28 家族分子結(jié)合，從而激活CD4+Th細(xì)胞，通過分泌細(xì)胞因子、募集并激活其他免疫細(xì)胞來啟動免疫反應(yīng)。在某些疾病狀態(tài)下，抗原呈遞也可成為機(jī)體自身免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。除上述專職抗原呈遞細(xì)胞外，上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚纖維母細(xì)胞及腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞均可扮演兼職抗原呈遞細(xì)胞的角色。研究表明，作為終末分化的足細(xì)胞，在特定致炎因素作用下，亦可具有抗原呈遞的特性，且以表達(dá)B7-1為主，目前尚無B7-2在足細(xì)胞特異性表達(dá)的證據(jù)[1]。

CTLA4-Ig通過選擇性結(jié)合B7-1分子，阻斷T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞之間B7-CD28共刺激通路，阻滯T細(xì)胞的活化以及由此介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用[5]。阿巴西普(Abatacept)作為目前臨床常用的CTLA4-Ig制劑，經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)已上市，其療效已在包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及腎移植排斥反應(yīng)等多種疾病的臨床實踐中得到驗證[6-7]。本品的常見不良反應(yīng)為頭痛、惡心、眩暈、咳嗽、背痛及皮疹等。因 CTLA4-Ig的分子量約為100 kD，不能被腎臟濾過，在合并腎功能受損患者中應(yīng)用，無嚴(yán)格劑量限制[8]。

足細(xì)胞B7-1抗原呈遞

研究表明，足細(xì)胞在多種刺激因子作用下能夠表達(dá)B7-1[1,9]。如在足細(xì)胞培養(yǎng)模型中，加入脂多糖，可出人意料檢測出B7-1的表達(dá)，脂多糖還可通過Toll樣受體4(TLR-4)與足細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架結(jié)合，最終影響足細(xì)胞裂孔隔膜的功能。在B7-1敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究表明，給予脂多糖及高糖刺激下，模型小鼠不會產(chǎn)生一過性的蛋白尿，這表明蛋白尿的產(chǎn)生是B7-1依賴的。在小鼠腎病綜合征模型中，也可觀察到在脂多糖誘導(dǎo)后，足細(xì)胞不但表達(dá)B7-1，同時伴隨著足細(xì)胞形態(tài)變化以及一過性輕微尿蛋白的產(chǎn)生。同樣缺氧誘導(dǎo)因子1可通過與B7-1相互作用影響足細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排，進(jìn)而增加足細(xì)胞的活動性。給小鼠注射Toll樣受體激動劑聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyIC，一種合成的雙鏈RNA)，不但可以使小鼠短暫出現(xiàn)蛋白尿，免疫組化還顯示腎臟足細(xì)胞表達(dá)B7-1，并伴隨尿中B7-1 的明顯升高。臨床研究表明在腎病綜合征微小病變(MCD)患者中，尿液中可檢出完整蛋白(分子量為5 300D)形式的B7-1，而并非血液中的游離片段(分子量為2 300D)，這也說明尿液中的B7-1可能來源于腎臟本身的分泌，而非來自血液的濾過。研究表明在T或B細(xì)胞缺失的SCID小鼠模型中，應(yīng)用CTLA4-Ig阻斷足細(xì)胞B7-1后可觀察到尿蛋白減少，該研究表明足細(xì)胞自身表達(dá)的B7-1在蛋白尿的產(chǎn)生中起主要作用，不一定需要完整的免疫系統(tǒng)參與。

研究表明，在免疫機(jī)制介導(dǎo)的腎臟疾病中如，足細(xì)胞不僅僅只是只是“受害者”，而且還能通過其扮演的抗原呈遞機(jī)制，在炎癥相關(guān)的腎小球疾病中發(fā)揮致病效應(yīng)[1]。在炎癥狀態(tài)下，足細(xì)胞可增加MHC-II分子的表達(dá)，通過其表達(dá)的免疫球蛋白N型受體清除來自于腎小球基膜(GBM)濾過的免疫球蛋白和(或)免疫復(fù)合物。與此同時，足細(xì)胞還可通過其表達(dá)的TLR介導(dǎo)IL-β、1型干擾素(IFN-1)和NF-κB依賴的細(xì)胞因子及趨化因子的釋放，并引發(fā)炎癥細(xì)胞的浸潤以及免疫介導(dǎo)的組織損傷[10]。而B7-1作為共刺激信號分子，可調(diào)高并活化TLR，提高TNF-α的刺激釋放T細(xì)胞趨化因子的活性，激活效應(yīng)性T細(xì)胞，促進(jìn)局部趨化因子的釋放，其本身在T細(xì)胞的活化過程中表達(dá)增加[9]。

B7-1介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為足細(xì)胞外端B7-1表達(dá)的上調(diào)與α3β1整合素的活動狀態(tài)密切相關(guān)[11]。足細(xì)胞足突可通過α3β1整合素縱向錨定于GBM，其錨定狀態(tài)依賴于整合素胞質(zhì)內(nèi)尾端與足細(xì)胞骨架蛋白的相互作用。研究表明，B7-1胞質(zhì)內(nèi)尾端對α3β1整合素活性的阻斷是必需的，B7-1的胞質(zhì)內(nèi)端可與踝蛋白(talin，細(xì)胞骨架相關(guān)性蛋白，在細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架相互間起橋蛋白的作用)競爭性結(jié)合，干擾整合素尾端與踝蛋白相互作用，從而可介導(dǎo)足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及功能損傷。在培養(yǎng)的足細(xì)胞模型，給予CTLA4-Ig處理后，可阻斷B7-1對α3β1整合素的作用，并阻止足細(xì)胞遷移，而足細(xì)胞遷移往往是腎小球濾過屏障受損的病因，在臨床上常伴隨著蛋白尿的產(chǎn)生。

正是基于足細(xì)胞抗原呈遞特性的認(rèn)識以及B7-1在介導(dǎo)足細(xì)胞損傷機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，CTLA4-Ig作為特異性蛋白尿控制靶向藥物首先應(yīng)用于難治性或利妥昔單抗抵抗且尿液B7-1陽性的局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者中，取得了蛋白尿緩解的良好效果，并發(fā)表于2013的新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上[2]。由于B7-1檢測技術(shù)的局限性，從一開始CTLA4-Ig應(yīng)用于腎臟病臨床治療就爭議不斷，但對于CTLA4-Ig的臨床應(yīng)用研究探索的腳步始終沒有停止。需要說明的是，目前尚無證據(jù)表明足細(xì)胞可表達(dá)B7-2因此，作為特異性的B7-1抑制劑目前腎科臨床CTLA4-Ig制劑主要為阿巴西普。目前阿巴西普在臨床應(yīng)用領(lǐng)域不但包括如MCD和FSGS等腎病綜合征[2,12-13]，還包括狼瘡性腎病等繼發(fā)性腎病以及糖尿病腎病等代謝相關(guān)性腎病[2]。臨床上另一種常用的CTLA4-Ig制劑是巴拉西普(Belatacept)可同時阻斷B7-1和B7-2，其器官移植后抗排斥效果優(yōu)于阿巴西普[14]。巴拉西普對B7-2結(jié)合力遠(yuǎn)高于B7-1，因此臨床上并沒有作為特異性的足細(xì)胞B7-1抑制劑使用。但考慮到非特異性阻斷B7-2對整體免疫系統(tǒng)影響，巴拉西普是否其在移植后腎病復(fù)發(fā)的療效會更確切，有待進(jìn)一步臨床驗證。

CTLA4-Ig在腎臟疾病的研究

FSGS和MCD 目前傾向于將MCD和FSGS看作是與足細(xì)胞損害相關(guān)同一種疾病的不同發(fā)病階段，MCD通常被視為疾病的早期階段，而FSGS被認(rèn)為是足細(xì)胞相關(guān)疾病的高級階段[15]。因此就足細(xì)胞抗原呈遞及CTLA4-Ig在FSGS和MCD中的作用將一并探討。

臨床研究表明，在復(fù)發(fā)的MCD患者中可觀察到尿液中B7-1表達(dá)的增加；與之相反在緩解期的MCD和FSGS患者中，尿液中B7-1的水平與正常人相似[12]。該研究引發(fā)的疑問在于復(fù)發(fā)MCD患者中，B7-1產(chǎn)生的細(xì)胞來源究竟是什么。該項臨床研究人員隨后的工作表明，對復(fù)發(fā)性MCD患者的腎病理切片的免疫組化研究顯示，B7-1幾乎完全表達(dá)于足細(xì)胞，而腎小管及間質(zhì)幾乎未見表達(dá)[16]。但是該研究并未描述在陽性對及陰性對照組B7-1免疫熒光表達(dá)情況。另一項發(fā)表于2015年由其他研究組報道的臨床結(jié)果也表明，在MCD患者尿液中B7-1水平的表達(dá)較FSGS患者明顯升高。但該文作者未能區(qū)分尿液中的B7-1到底是來源于腎臟本身抑或血液[17]。

迄今為止，支持B7-1作為生物標(biāo)志及治療靶點的最重要研究發(fā)表于2013年的《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》。在該研究中，作者將B7-1拮抗劑阿巴西普成功應(yīng)用于5例復(fù)發(fā)或初發(fā)的FSGS患者并提出了B7-1介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷機(jī)制[2]。作者認(rèn)為正常情況下足細(xì)胞足突可將α3β1整合素縱向錨定于腎小球基底膜，疾病狀態(tài)下B7-1的胞質(zhì)內(nèi)端可與踝蛋白競爭性結(jié)合，干擾整合素尾端與踝蛋白相互作用從而可介導(dǎo)足細(xì)胞的形態(tài)及功能損傷。CTLA4-Ig通過阻斷B7-1胞外段進(jìn)而可干擾B7-1跨胞漿膜內(nèi)段，干擾α3β1 整合素與足細(xì)胞骨架復(fù)合體的錨定結(jié)合，籍此可抑制由此啟動的疾病發(fā)生過程，修復(fù)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而修復(fù)腎小球濾過屏障，從而減少蛋白尿的產(chǎn)生?？紤]到目前臨床對復(fù)發(fā)性FSGS尤其是腎移植后復(fù)發(fā)的FSGS治療選擇不多，該研究的結(jié)果令人鼓舞，這表明B7-1不但可作為某些腎臟疾病的新興生物學(xué)標(biāo)志，而且還有可能成為重要的治療靶點，尤其是那些移植后又復(fù)發(fā)的FSGS患者。因此在現(xiàn)階段，旨在驗證B7-1作為難治性腎病綜合征生物標(biāo)志可行性及CTLA4-Ig有效性的多中心、隨機(jī)、前瞻性臨床研究計劃是不可或缺的[18-19]。

狼瘡性腎炎將阿巴西普應(yīng)用于狼瘡性腎炎治療的設(shè)想是基于對藥理學(xué)機(jī)制的認(rèn)識，通過阻斷B7-1-CD28在T淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞免疫激活中的作用，阿巴西普有可能干預(yù)狼瘡性腎炎的發(fā)病機(jī)制，從而發(fā)揮治療效應(yīng)。早期在鼠類狼瘡腎炎模型的研究證實，CTLA4-Ig可阻斷甚至于逆轉(zhuǎn)狼瘡腎臟損害病理改變[9]。研究表明，在所有WHO狼瘡性腎炎病理類型中， Ⅴ型患者的B7-1表達(dá)最高；當(dāng)狼瘡性腎炎患者由Ⅱ級轉(zhuǎn)化為Ⅴ型時，其足細(xì)胞B7-1的表達(dá)會增加，并與蛋白尿程度正相關(guān)。臨床研究表明(NCT00430677)，阿巴西普可使受試?yán)钳徯阅I炎患者的蛋白/肌酐比值下降20%～30%，但并不增加狼瘡性腎炎患者的完全緩解率[6]。

糖尿病腎病在細(xì)胞培養(yǎng)模型中，給予高糖刺激下，足細(xì)胞會高表達(dá)B7-1。研究表明，當(dāng)足細(xì)胞暴露于高糖(30 mmol/L)環(huán)境中，可觀察到時間依賴性的，由PI3K介導(dǎo)的足細(xì)胞高B7-1表達(dá)，這往往與足細(xì)胞特異性突觸連接蛋白及α3β1整合素表達(dá)的受損有關(guān)，同時伴隨著細(xì)胞骨架蛋白肌動纖維絲的破壞以及細(xì)胞活動度的下降[20]。令人關(guān)注的是，在培養(yǎng)基中加入CTLA4-Ig，可逆轉(zhuǎn)上述病理損傷的發(fā)生。同樣，高糖環(huán)境下的足細(xì)胞B7-1高表達(dá)，可誘發(fā)足細(xì)胞的凋亡及壞死，而預(yù)先予以CTLA4-Ig，則可顯著減少足細(xì)胞的程序性死亡或壞死。在硫脲菌素誘發(fā)C57BL/6 1型糖尿病小鼠及2型糖尿病小鼠(db/db)模型中，足細(xì)胞B7-1表達(dá)的上調(diào)同樣與蛋白尿的產(chǎn)生及腎功能的受損有關(guān)，予以CTLA4-Ig后，則可防止蛋白尿的增加并可減輕腎組織病理學(xué)損害。在B7-1敲除的小鼠糖尿病模型中，其蛋白尿產(chǎn)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型糖尿病小鼠，而應(yīng)用CTLA4-Ig并不能帶來進(jìn)一步的獲益，這同樣證明B7-1不但在腎臟功能的改變中其重要作用，而且也是CTLA4-Ig取得療效的重要作用靶點。臨床實際中，在合并腎損害的2型糖尿病患者的腎活檢病理中，可見足細(xì)胞B7-1表達(dá)的上調(diào)，且表達(dá)水平與腎功能損害相關(guān)，通常伴隨足細(xì)胞特異性突觸連接蛋白的減少[20]。盡管目前尚無將CTLA4-Ig應(yīng)用于糖尿病腎病治療的臨床研究正式報道，但鑒于B7-1在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制所起的作用，尤其是對于臨床上僅表現(xiàn)為蛋白尿，而實際上腎功能儲備可能處于迅速衰退邊緣的2型糖尿病合并腎損害的患者，專注于蛋白尿控制的CTLA4-Ig，在臨床實際的應(yīng)用，將無疑會為是這類人群帶來福音[21]。

研究前景和爭論目前就各種足細(xì)胞相關(guān)腎臟病中，B7-1的表達(dá)是否為特異性地表達(dá)于足細(xì)胞，是各方重點關(guān)注和爭論的焦點，而CTLA4-Ig制劑在腎臟病真實世界中的臨床療效也爭議不斷。

研究者發(fā)現(xiàn)在臨床診斷為糖尿病腎病患者中，無論在冰凍的新鮮切片或石蠟包埋切片時，只能發(fā)現(xiàn)微量甚或位于腎間質(zhì)或腎小管細(xì)胞的B7-1非特異性表達(dá)[22]。早期動物研究表明，給予脂多糖及高糖刺激下，B7-1基因敲除小鼠不會產(chǎn)生一過性的蛋白尿，盡管關(guān)于B7-1基因敲除小鼠免疫組化最新研究表明，B7-1基因敲除有可能只是影響了小鼠淋巴結(jié)及脾臟的B7-1表達(dá)，而腎臟組織中仍然可以觀察B7-1的表達(dá)[23]。在硫脲菌素誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠糖尿病模型，也未能觀察到足細(xì)胞B7-1的表達(dá)[24]。而隨后的阿巴西普干預(yù)，僅觀察到腎臟組織T淋巴細(xì)胞浸潤的減少，有作者認(rèn)為這可能有助于減少微量蛋白尿的產(chǎn)生，但阿巴西普對糖尿病整體病情的進(jìn)展并無明顯作用。

同樣的疑問也發(fā)生在狼瘡性腎炎患者，盡管應(yīng)用了多種替代抗體和免疫組化方法，研究者仍然未能在足細(xì)胞觀察到B7-1的特異性表達(dá)，僅有的微弱表達(dá)也只見于腎間質(zhì)組織中的浸潤炎癥細(xì)胞上[25]。而這種情況同樣不但發(fā)生于NZB/W狼瘡模型小鼠中，也同樣于MRI-Faslpr轉(zhuǎn)基因小鼠中[26]。而阿巴西普改善蛋白尿的機(jī)制被認(rèn)為與其拮抗免疫系統(tǒng)B7-1-CD28信號傳導(dǎo)途徑從而減少免疫細(xì)胞的早期活化有關(guān)[27]。這也同樣被用于解釋阿巴西普治療自身免疫性疾病的療效機(jī)制。

盡管B7-1作為生物標(biāo)志及治療靶點的研究已發(fā)表于2013年的《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》，但圍繞足細(xì)胞B7-1的特異性表達(dá)及阿巴西普在MCD及FSGS等患者可行性的疑問始終存在。有研究者采該文中所提供的免疫組化技術(shù)路線，在反復(fù)發(fā)作甚至移植后復(fù)發(fā)的FSGS患者腎臟病理切片上，未發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞B7-1的特異性表達(dá)[28]。其他研究者也在復(fù)發(fā)的FSGS患者，同樣未檢測到腎小球足細(xì)胞B7-1的特異性表達(dá)[29]。進(jìn)一步研究表明即便有某些MCD或膜性腎病患者中可檢測到B7-1的表達(dá)，而這些無一例外地均不表達(dá)在足細(xì)胞上，其中大多數(shù)表達(dá)于腎小管細(xì)胞上[28,30]。而阿巴西普在MCD及FSGS臨床效果，也只在少數(shù)患者M(jìn)CD觀察到蛋白尿的一過性減少，以至于參與實驗的研究者認(rèn)為足細(xì)胞B7-1可能在MCD的蛋白尿產(chǎn)生起一定作用，或許在FSGS的復(fù)發(fā)中根本不起作用[13]。有些研究者發(fā)現(xiàn)經(jīng)脂多糖注射的小鼠及阿霉素誘導(dǎo)的腎病模型小鼠中，也未能觀察到足細(xì)胞特異性B7-1的表達(dá)[31]。鑒于多數(shù)關(guān)于足細(xì)胞特異性B7-1表達(dá)的臨床研究或動物模型均未能獲得陽性的表達(dá)，這使許多研究者懷疑發(fā)表于2013年的《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上作者所提出的假設(shè)機(jī)制是否可行。有研究者認(rèn)為阿巴西普在某些FSGS患者有效的原因可能與阻斷B7-1- CD28共刺激通路，進(jìn)而阻斷由此觸發(fā)的級聯(lián)放大信號通路，并最終降低參與FSGS發(fā)病的循環(huán)致病因子活性有關(guān)[32]。

圖1 抗原遞呈及CTLA4-Ig阻斷機(jī)制假設(shè)示意圖[21]A：CTLA4-Ig阻斷經(jīng)典的抗原遞呈簡圖；通過阻斷CD28與B7-1結(jié)合，CTLA4-Ig可以阻滯T細(xì)胞的活化及由此介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)的作用；B:足細(xì)胞抗原遞呈及CTLA4-Ig阻斷機(jī)制假設(shè)簡圖；通過阻斷B7-1胞外段進(jìn)而可干擾其跨胞漿膜內(nèi)段α3β1整合素與足細(xì)胞骨架復(fù)合體的錨定結(jié)合，CTLA4-Ig可抑制由此啟動的疾病發(fā)生過程并修復(fù)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能。TCR：T細(xì)胞受體；MHC-Ⅱ:主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類分子；Paxillin:樁蛋白；Talin:踝蛋白；Actin：肌動蛋白；Synaptopodin:突觸連接蛋白；FAK：黏著斑激酶；Cas：Crk相關(guān)底物蛋白

小結(jié):足細(xì)胞類免疫細(xì)胞活性，尤其是抗原呈遞特性的發(fā)現(xiàn)，對探討包括狼瘡性腎炎、糖尿病腎腎病、MCD、FSGS及膜性腎病等腎小球足細(xì)胞疾病的發(fā)病機(jī)制有重要作用。阻斷由足細(xì)胞啟動的抗原呈遞過程，有望為治療此類疾病的新的途徑[33-34]。但圍繞足細(xì)胞是否能特異性表達(dá)B7-1及其與之相關(guān)的足細(xì)胞疾病發(fā)病機(jī)制中的作用等疑問持續(xù)存在，而回答這些問題將充滿挑戰(zhàn)。將來尋找并建立切實可行的檢測足細(xì)胞特異性表達(dá)B7-1方法將是至關(guān)重要的一步，以此為靶點CTLA4-Ig制劑在以蛋白尿為臨床表現(xiàn)的腎臟疾病中的應(yīng)用，必定要建立在堅實的臨床前期工作基礎(chǔ)上。