廖 娟，韓布新，李 靜，趙 楠

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腫瘤科 北京 100091）

腫瘤作為一種應(yīng)激，必然會(huì)使患者產(chǎn)生緊張、焦慮、抑郁等情緒反應(yīng)，而這種長(zhǎng)期、慢性的應(yīng)激，則引起下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）功能亢進(jìn)，導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)形態(tài)與功能的損傷[1,2]。撳針作為微型針灸針，于傳統(tǒng)針灸針相比，最大的優(yōu)點(diǎn)在于延長(zhǎng)了針刺效應(yīng)的時(shí)間[3]，撳針已廣泛應(yīng)用于對(duì)腫瘤相關(guān)抑郁狀態(tài)的臨床干預(yù)，但缺乏客觀臨床療效數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)數(shù)據(jù)支持，本實(shí)驗(yàn)觀察撳針對(duì)腫瘤抑郁模型小鼠血清五羥色胺（5-HT）和腎上腺素（EBI）水平及腦組織海馬中CA1 區(qū)細(xì)胞層數(shù)目及結(jié)構(gòu)改變，探討撳針抗抑郁的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

用雄性昆明小鼠50 只，8-12 周齡，體重18-20 g，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證：SCXK（滬）2007-0005。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24℃，濕度為40%-50%，在西苑醫(yī)院動(dòng)物房大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，觀察無(wú)異常納入實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 HE實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)器材：Tissue-TEK VIP6 生物組織脫水機(jī)（日本櫻花公司）；Tissue-TEK TEC 生物組織包埋機(jī)（日本櫻花公司）；Leica RM2235 組織切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；Leica CV5030 自動(dòng)封片儀（德國(guó)萊卡公司）；Olympus BX53 顯微鏡（美國(guó)奧林帕斯公司）；Path QC病理質(zhì)控和資料管理系統(tǒng)（中國(guó)朗珈公司）。

1.1.3 主要試劑和針具

小鼠5 羥色胺ELISA 試劑盒、小鼠腎上腺素（EPI）ELISA試劑盒，北京派拓科技有限公司生產(chǎn)；針具為華佗牌一次性撳針（0.22 × 2.0 mm），蘇州醫(yī)療用品有限公司；華成牌一次性無(wú)菌針灸針，0.25 × 25 mm（生產(chǎn)許可證號(hào)：京食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20110003號(hào)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及干預(yù)

選取健康雄性昆明小鼠45 只小鼠均在其腹腔內(nèi)注射S180 瘤株，制備腫瘤模型。腫瘤造模成功后，腫瘤小鼠均進(jìn)行為期14 d 的慢性不可預(yù)知溫和刺激（CUMS）抑郁造模，造模成功后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為撳針組、傳統(tǒng)針灸組，腫瘤抑郁造模組，以5 只健康雄性昆明小鼠作為正常對(duì)照，集體飼養(yǎng)。撳針組、傳統(tǒng)針灸組均針刺“百會(huì)”、“印堂”干預(yù)14 d。2 周后觀察小鼠海馬結(jié)構(gòu)改變，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定小鼠血清五羥色胺（5-HT）和腎上腺素（EBI）水平。每籠5 只，其余各組小鼠單籠飼養(yǎng)。自然對(duì)照組及腫瘤抑郁模型組不作處理。撳針組選取小鼠百會(huì)、印堂穴為治療穴位，埋針48 h，每周3 次。傳統(tǒng)針灸組選取小鼠百會(huì)、印堂穴每2 d 1次，每次留針20 min。干預(yù)2周。

1.2.2 曠場(chǎng)試驗(yàn)

將大鼠置于實(shí)驗(yàn)箱的箱底中央格,敞箱頂部攝像頭記錄其5 min 內(nèi)的活動(dòng)并通過(guò)連接電腦儲(chǔ)存分析數(shù)據(jù)。每只大鼠測(cè)試結(jié)束后，立即清理箱內(nèi)的糞便及尿液，同時(shí)使用75%酒精噴灑擦拭實(shí)驗(yàn)箱，避免前只大鼠所遺留氣味對(duì)下只大鼠行為檢測(cè)造成影響。

1.2.3 電鏡

取新鮮海馬組織1 mm3，經(jīng)Leica RM2235 組織切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）修塊，Leica ST5020（德國(guó)萊卡公司）自動(dòng)染色機(jī)染色，再經(jīng)Leica CV5030 自動(dòng)封片儀（德國(guó)萊卡公司）封片固定；Olympus BX53 顯微鏡（美國(guó)奧林帕斯公司）；Path QC 病理質(zhì)控和資料管理系統(tǒng)（中國(guó)朗珈公司）。

1.3 小鼠造模建立

基于文獻(xiàn)[4]，關(guān)于接種S180腹腔肉瘤瘤株后，瘤體在小鼠體內(nèi)生存期為5 周的研究結(jié)論，本課題組討論決定修改整個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案：腫瘤造模1周、抑郁造模2周、撳針干預(yù)2周，共5周的小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 小鼠腫瘤造模建立

健康雄性昆明小鼠50 只，除自然對(duì)照組（Group A）5 只小鼠一起飼養(yǎng)在同一個(gè)籠子中，其余45 只小鼠先進(jìn)行腫瘤造模：S180 腹腔肉瘤瘤株（北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心培養(yǎng)）注射到小鼠腹腔，1周后觀察其小鼠腹腔腫瘤瘤體是否接種成功，周期為1周。

S180 腫瘤模型的建立：復(fù)蘇S180 細(xì)胞，腹腔注射KM 雌性兩只，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，取S180 肉瘤7 d 生長(zhǎng)良好的腹水型小鼠，在無(wú)菌操作下抽取腹水，用滅菌的生理鹽水稀釋，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為6 個(gè)·mL-1，置于冰水中保存?zhèn)溆?；?0 只昆明小鼠機(jī)取出5 只作為空白對(duì)照組，其余45 只，每只左前肢腋窩皮下接種S180 瘤細(xì)胞懸液0.2 mL；接種1周后觀察成瘤情況。

1.3.2 小鼠抑郁模型的建立

參考Willner的研究[5]并改進(jìn)。采用慢性不可預(yù)知溫和刺激造模。在抑郁造模開(kāi)始前，實(shí)施預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：腫瘤接種成功小鼠不能承受Willner的研究中慢性不可預(yù)知溫和刺激造模步驟，分析其原因，可能與腫瘤小鼠體內(nèi)瘤負(fù)荷不斷加大，自身免疫力降低因素相關(guān)，故減少對(duì)腫瘤小鼠抑郁刺激造模到刺激強(qiáng)度和時(shí)間，共接受14 d7 種不同應(yīng)激，包括熱水游泳（38℃，3 min）、冷刺激（4℃，3 min）、禁食24 h、禁水24 h、晝夜顛倒、潮濕鼠籠24 h、夾尾懸尾（1 min），每天隨機(jī)安排1 種，使小鼠不能預(yù)料刺激到發(fā)生，刺激周期為2周。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將昆明小鼠分為撳針組、傳統(tǒng)針灸組、腫瘤造模對(duì)照組，各組各8 只。自然對(duì)照組（Group A）：在相同條件下，5 只健康昆明小鼠正常飼養(yǎng)，一起飼養(yǎng)在同一籠中，不作任何造模和干預(yù)處置，觀察周期2周。

1.4.2 腫瘤抑郁模-撳針組（Group B）

8只腫瘤小鼠接受撳針干預(yù)，采用直徑為0.22 mm，長(zhǎng)度為2.5 mm 的撳針，即：將0.2 mm×1.5 mm 撳針埋入CUMS 大鼠，埋針24 h 后取出，每周2 次，周末不埋針，連續(xù)2周。

1.4.3 腫瘤抑郁模-傳統(tǒng)針灸組（Group C）

8 只腫瘤小鼠接受傳統(tǒng)針灸干預(yù)，采用直徑為0.22 mm，長(zhǎng)度為25 mm 的傳統(tǒng)針灸，取百會(huì)、大椎，本研究大鼠干預(yù)的穴位參照全國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴譜》選取穴位[9]。選用0.25 mm×15 mm 毫針，百會(huì)穴向前平刺2 mm，大椎直刺2 mm，平補(bǔ)平瀉法，固定小鼠留針20 min，每周2次，周末不埋針，連續(xù)2周。

1.4.4 腫瘤抑郁模型組（Group D）

8只腫瘤小鼠不接受任何干預(yù)，連續(xù)2周。

圖1 小鼠血清內(nèi)5-HT、EPI含量（ng·mL-1）

1.5 指標(biāo)觀察

1.5.1 血清5羥色胺（5-HT）及腎上腺素（EPI）的測(cè)定

各組動(dòng)物于第14 d 末次治療的24 h 后，快速斷頭取血，血液在冰浴試管中靜止30 min。4℃，3000 r·min-1離心10 min，分離血清，保存在-80℃的冰箱中，以備待測(cè)。用ELISA 免疫分析法測(cè)定血清皮質(zhì)醇和血清5羥色胺（5-HT）及腎上腺素（EPI）的含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，棄去液體，重復(fù)洗滌5次。

1.5.2 海馬組織CAl區(qū)的細(xì)胞層數(shù)變化

腫瘤抑郁造模14 d，各組不同干預(yù)2 周后，每組取7 只小鼠，用頸椎脫臼法處死后立即解剖，取海馬，下丘腦組織標(biāo)本，固定于4%多聚甲醛中。24 h 后乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，4 um 切片，進(jìn)行HE 染色和免疫組化，光鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)用SPSS13.0 軟件統(tǒng)計(jì)包處理，以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用方差分析（ANOVA），以P＜0.01為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠ELISA法測(cè)5-HT及EPI含量（ng·mL-1）

在應(yīng)激后第14 d 處死小鼠，快速冰凍取腦，采用ELISA 方法測(cè)定5-HT 及EPI 含量。傳統(tǒng)針灸組小鼠血清5 羥色胺（5-HT）及腎上腺素（EPI）含量較其他3組均顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；撳針組與腫瘤抑郁模型組和自然飼養(yǎng)組血清5 羥色胺（5-HT）及腎上腺素（EPI）含量比較，均有明顯降低趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；可見(jiàn)通過(guò)針刺干預(yù)后，抑郁模型小鼠血清5 羥色胺（5-HT）及腎上腺素（EPI）含量均能顯著下降，從而通過(guò)抑郁亢進(jìn)的HPA 軸發(fā)揮治療腫瘤相關(guān)性抑郁到作用（圖1）。

圖2 自然飼養(yǎng)組（D組）

圖3 腫瘤抑郁模型組（C組）

圖4 撳針組（A組）小鼠

2.2 海馬組織CAl區(qū)的細(xì)胞層數(shù)變化

自然飼養(yǎng)組（圖2）顯示小鼠海馬CA1 區(qū)細(xì)胞層數(shù)；腫瘤抑郁模型組（圖3）小鼠海馬CA1 區(qū)細(xì)胞層數(shù)3-4 層，錐體細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞固縮變性。撳針組（圖4）和傳統(tǒng)針灸組（圖5）海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元層次增加，排列清晰，固縮和空泡化的核減少，細(xì)胞脫落少見(jiàn)。

圖5 傳統(tǒng)針灸組（B組）

3 討論

3.1 腫瘤相關(guān)抑郁狀態(tài)的中醫(yī)認(rèn)識(shí)

腫瘤相關(guān)抑郁狀態(tài)（Cancer related depression,CRD）是以腫瘤為基礎(chǔ)疾病而引發(fā)的一組癥狀或狀態(tài)，對(duì)腫瘤患者的生存質(zhì)量產(chǎn)生直接影響[6]；我國(guó)腫瘤相關(guān)性抑郁在腫瘤疾病中發(fā)病率約為25.8-58.0%，要顯著高于正常人群抑郁癥的發(fā)病率（18.37%）[7-9]。抑郁發(fā)病根源源于腦神紊亂[10]，當(dāng)氣機(jī)失調(diào)時(shí)，腦神紊亂而使五臟功能失調(diào)，郁證發(fā)生。腦為元神之府，督脈入絡(luò)腦，神庭、百會(huì)穴位于督脈上，是臨床治療抑郁癥的常用腧穴，有調(diào)理腦神之功效,針刺刺激腧穴可增強(qiáng)經(jīng)絡(luò)的經(jīng)氣傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)免疫、內(nèi)分泌及神經(jīng)系統(tǒng)，達(dá)到安神解郁目的[11]，所以治郁必先治腦，腦氣通調(diào)，則郁自解，神自寧。

3.2 針刺穴位及療效

針刺作為應(yīng)激刺激的一種,和其他應(yīng)激刺激都能促進(jìn)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能，促進(jìn)AcTH的分泌，增加腎上腺皮質(zhì)重量[12]。既往研究顯示，中醫(yī)針刺在治療抑郁癥方面具有較好的有效性、安全性和患者可接受性，但其抗抑郁的效應(yīng)機(jī)制仍未明晰[13-16]。百會(huì)屬督脈，督脈是諸陽(yáng)經(jīng)之匯，對(duì)整個(gè)經(jīng)脈系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用，其主干行于脊里，上行至風(fēng)府進(jìn)入腦內(nèi)，上循顛頂，故督脈與腦、脊髓有密切關(guān)系，歷代醫(yī)家素有“病變?cè)谀X，首取督脈”之說(shuō)[17]，印堂為經(jīng)外奇穴，督脈經(jīng)氣流注之所，具有醒腦安神作用。前期臨床研究證實(shí)[18-19]，電針百會(huì)、印堂可以緩解抑郁癥情緒低落的主癥，還可整體調(diào)節(jié)機(jī)體，療效與藥物百憂解相當(dāng)。

實(shí)驗(yàn)研究[20,21]亦表明，電針百會(huì)、印堂可改善不同抑郁模型大鼠抑郁樣行為，故本研究采用百會(huì)、印堂穴進(jìn)行干預(yù)。既往研究顯示針刺治療抑郁癥有效率83%[22]，其中采用“通督調(diào)神針?lè)ā钡目傆行蔬_(dá)96.7%，這些都為針灸治療抑郁提供新道思路和方向[23]。針灸治療抑郁癥的機(jī)理逐年增多，督脈為諸陽(yáng)之匯，統(tǒng)督全身陽(yáng)氣，養(yǎng)腦安神，是臨床上治療抑郁癥最常見(jiàn)的穴位[24,25]，針刺能夠興奮大腦皮層，促進(jìn)抗抑郁物質(zhì)釋放，修復(fù)受損神經(jīng)功能，改善患者的抑郁癥狀[24,26]。本次研究，撳針百會(huì)增加抑郁小鼠行為學(xué)改善，提高其血清5-HT 含量，有效調(diào)節(jié)腫瘤抑郁小鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（HPA 軸）功能，與既往同類(lèi)研究一致。

3.3 腎上腺素和5-羥色胺類(lèi)與抑郁的關(guān)系

本研究自然飼養(yǎng)組的5-HT 含量的平均值為1.773 ng·mL-1，腫瘤抑郁造模后，造模組5-HT 含量的平均值降至1.498 ng·mL-1，提示抑郁導(dǎo)致5-HT含量的降低，與既往研究一致[27]。經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后，針灸組5-HT 含量的平均值0.364 ng·mL-1，撳針組的5-HT 含量平均值為0.519 ng·mL-1，均比造模組提高，提示針刺能夠提高抑郁5-HT 含量，表明針刺能夠改善抑郁狀態(tài)。針灸組能夠很好的改善腫瘤相關(guān)性抑郁。從圖1 顯示，自然飼養(yǎng)組的5-HT 含量的平均值為1.773 ng·mL-1，腫瘤抑郁造模后，造模組5-HT 含量的平均值降至1.498 ng·mL-1，提示抑郁導(dǎo)致5-HT 含量的降低，與既往研究一致[27]。經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后，從圖顯示，針灸組5-HT 含量的平均值0.364 ng·mL-1，撳針組的5-HT 含量平均值為0.519 ng·mL-1，均比造模組提高，提示針刺能夠提高抑郁5-HT 含量，表明針刺能夠改善抑郁狀態(tài)。針灸組能夠很好的改善腫瘤相關(guān)性抑郁（圖1）。同理，自然飼養(yǎng)組的EBI 含量的平均值為0.127 ng·mL-1，腫瘤抑郁造模后，EBI 含量的平均值升高到0.174 ng·mL-1，提示抑郁導(dǎo)致EBI 含量升高，經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后，針灸組的EBI含量的平均值為0.146 ng·mL-1，撳針組的的EBI 含量的平均值為0.150 ng·mL-1，均比造模組降低，提升針刺能夠改善抑郁狀態(tài)（圖2）。

3.4 海馬組織CAl區(qū)的細(xì)胞層數(shù)變化

本研究通過(guò)觀察腫瘤抑郁造模小鼠針刺干預(yù)后海馬CA1 區(qū)細(xì)胞層數(shù)的改變，發(fā)現(xiàn)在腫瘤抑郁模型組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞層數(shù)3-4層，錐體細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞固縮變性（圖3）。撳針組（圖4）和傳統(tǒng)針灸組（圖5）海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元層次增加，排列清晰，固縮和空泡化的核減少，細(xì)胞脫落少見(jiàn)。從上述光鏡下各組海馬CAl 區(qū)的細(xì)胞層數(shù)變化，可知腫瘤相關(guān)性抑郁能導(dǎo)致小鼠海馬CAl 區(qū)的細(xì)胞層數(shù)減少，細(xì)胞固縮變性，導(dǎo)致海馬體積縮小，與既往抑郁相關(guān)研究結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后，小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元層次增加，排列清晰，固縮和空泡化的核減少，細(xì)胞脫落少見(jiàn)，證實(shí)針刺能夠有效恢復(fù)小鼠海馬CAl 區(qū)的細(xì)胞層數(shù)，改善抑郁海馬結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步改善腫瘤相關(guān)性抑郁。既往研究顯示，海馬體積減小與海馬神經(jīng)元數(shù)目減少、頂樹(shù)突萎縮、線粒體嵴破壞、突觸小泡數(shù)量減少等有直接聯(lián)系[17]。

本次研究結(jié)果顯示，自然對(duì)照組海馬結(jié)構(gòu)完好，而腫瘤抑郁模型組海馬結(jié)構(gòu)病理改變明顯，表現(xiàn)為小鼠海馬CAl區(qū)的細(xì)胞層數(shù)減少，細(xì)胞固縮變性，導(dǎo)致海馬體積縮小，與既往抑郁相關(guān)研究結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后，小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元層次增加，排列清晰，固縮和空泡化的核減少，細(xì)胞脫落少見(jiàn)，證實(shí)針刺能夠有效恢復(fù)小鼠海馬CAl 區(qū)的細(xì)胞層數(shù)，改善抑郁海馬結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步改善腫瘤相關(guān)性抑郁。本次研究結(jié)果提示，撳針可以修復(fù)腫瘤抑郁小鼠海馬結(jié)構(gòu)到破壞。既往研究顯示，5-羥色胺受體在抑郁癥患者腦中所含的數(shù)目要比普通人腦中所含的數(shù)目低[27]。

海馬內(nèi)5-HT 含量改變是抑郁癥的敏感指標(biāo)（楊亦龍等，2015）。5-HT 含量減低出現(xiàn)抑郁癥狀，增加海馬5-HT 含量治療，可使抑郁癥狀早期得到明顯改善[28]。

綜上，撳針對(duì)腫瘤相關(guān)性抑郁小鼠具有抗抑郁作用，該作用可能通過(guò)提高小鼠血清中的5 羥色胺含量和降低腎上腺素含量而實(shí)現(xiàn)，從而調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺素軸功能狀態(tài)，改善小鼠腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元層次增加，改善海馬體積實(shí)現(xiàn)到。