曾志聰，林豐夏，張元貴，吳 偉，宋銀枝，李亮＊＊

（1.深圳市寶安中醫(yī)院（集團(tuán)）心血管病科 深圳 518100；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣州 510006）

心力衰竭（心衰）是各種心血管疾病的終末期階段，目前的發(fā)病率及死亡率居高不下[1]。當(dāng)高血壓、心臟瓣膜病等致心臟壓力負(fù)荷過重時，心臟會代償性的出現(xiàn)心肌肥厚，表現(xiàn)為心肌肥大，蛋白表達(dá)的增加，以增強(qiáng)心室收縮功能，目的是對抗過高的壓力負(fù)荷，維持心臟泵血功能的穩(wěn)定[2]。雖然早期心肌肥大對于維持正常心功能具有一定的代償意義，但是這種刺激持續(xù)存在將會引起交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度激活，釋放血管緊張素及兒茶酚胺類等激素，造成心肌細(xì)胞氧耗量的增加，一旦心臟血供不能滿足肥厚心肌的需求時，即會發(fā)生心衰，顯著增加惡性心律失常、心源性猝死的風(fēng)險性，嚴(yán)重威脅人類生命。因此，對于早期心肌肥大的抑制可以延緩其進(jìn)入心力衰竭期，降低心衰的死亡率。目前認(rèn)為長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）在心衰治療中應(yīng)用潛力巨大，其原因在于它可以通過在分子水平上的巨大調(diào)控力影響細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，并進(jìn)一步影響疾病的發(fā)展[3-5]。其中，有研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA-MIAT（LncRNA-myocardial infarctionrction-associated transcript,LncRNA-MIAT）在病理或應(yīng)激狀態(tài)下，可以通過調(diào)控自噬參與心肌肥大的發(fā)展過程[6,7]。

中醫(yī)藥是中華民族原創(chuàng)的醫(yī)學(xué)科學(xué)，蘊(yùn)含著解決人類健康問題的寶貴智慧，為治療心衰提供了獨特見解和思路。黃連就是被歷代醫(yī)家廣泛應(yīng)用的一種傳統(tǒng)中藥材，其提取物小檗堿（Berberine,BBR）被臨床工作者證實可以抑制心肌肥大，拮抗心室重構(gòu)，減少心衰患者的死亡率、再住院率，在心衰治療上具有潛力。但是小檗堿抑制心肌肥大的機(jī)制目前并不是很清楚。本研究探索了心肌細(xì)胞肥大狀態(tài)下LncRNA-MIAT 與自噬通路蛋白腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ、P62 的表達(dá)水平，進(jìn)而驗證小檗堿抑制心肌細(xì)胞肥大是否與其調(diào)控LncRNA-MIAT 和自噬的能力有關(guān)。

表1 干擾片段基因序列

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠心肌細(xì)胞H9C2 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，鹽酸小檗堿（批號A600129-0005）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ，批號A07852）均購自Sigam（上海）公司，DEME 培養(yǎng)基（批號C11875500BT）、胎牛血清（批號16000-044）、青鏈霉素混合液（批號15140-122）、0.25%的胰蛋白酶（批號25200-072）、一抗、二抗等主要試劑均購自碧云天生物科技有限公司，Trizol試劑（批號TR118-500）、RNA 試劑提取盒（批號Trizol）購自MRC（美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號M1705）、GoTaq? qPCR Master Mix（批號A6002）購自Promega（北京）；質(zhì)粒及引物的設(shè)計和合成委托上海生工生物公司完成。

1.2 主要儀器

旋渦振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，vortex-5）、手提式高速分散器（寧波新芝生物科技有限公司，S10）、紫外可見分光光度計（上海奧譜勒儀器有限公司，UV-752P）、移液槍（Eppendorf）、紫外透射分析儀（Hema,UV-3A）、電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，JA1003N）、冷凍高速離心機(jī)（Hema,TGL-16R）、基因擴(kuò)增儀（Hema,Hema9600）、倒置顯微鏡（NIKON）。

1.3 方法

1.3.1 H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)與心肌細(xì)胞肥大模型建立

將獲得的H9C2 心肌細(xì)胞置于DEME 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到80-90%時，吸取培養(yǎng)基。用PBS洗滌細(xì)胞2 次。再加入0.25%的胰蛋白酶溶液5 mL，并放于37℃培養(yǎng)箱2-3 min。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，若細(xì)胞將要分離并呈現(xiàn)圓粒狀時，立即倒掉胰蛋白酶溶液，并加入適量含胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基終止胰蛋白酶溶液作用。用吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，補(bǔ)足培養(yǎng)基，按1∶2進(jìn)行傳代。最后放入37℃中的5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到80-90%且狀態(tài)良好時，于-80℃的低溫冰箱液氮罐凍存?zhèn)溆?。將解凍后的H9C2 心肌細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液（10%胎牛血清）中，培養(yǎng)48 h 后的H9C2 心肌細(xì)胞換無血清培養(yǎng)液饑餓12 h 后，用稀釋后濃度為10-6mol·L-1的AngⅡ溶液干預(yù)誘導(dǎo)48 h，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及單位面積下心肌細(xì)胞數(shù)量，用圖像分析軟件image pro plus 6.0 分析計算心肌細(xì)胞平均表面積（μm2），面積計算公式為：細(xì)胞平均表面積=總面積÷細(xì)胞個數(shù)。

1.3.2 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒干擾LncRNA-MIAT

細(xì)胞消化后，接種至24孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2 d 細(xì)胞密度為80%，吸去培養(yǎng)基。200 pmol 干擾片段溶于250μl opti-MEM 中，混勻、靜置。將1.5 μl Lipofectamine 2 000 溶于250 μl opti-MEM 中，輕輕混勻，室溫靜置5 min。將片段和脂質(zhì)體溶液混勻，室溫靜置20 min，滴加至6 孔板孔中，混勻，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h 后，吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入2 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后行qPCR檢測和Western blotting檢測。

1.3.3 qPCR檢測LncRNA-MIAT的表達(dá)

用Trizol 提取心肌細(xì)胞的總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：70℃5 min，冰上5 min，42℃60 min。使 用GoTaq?qPCR Master Mix 將cDNA 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：熱變性95℃120 s 1 cycle，變性95℃15 s，退火延伸60℃30 s，40 cycle，溶解曲線60-95°C。所用引物序列為：MIAT,F 5'-GAGGGAAGTTCTGAGCTTGG-3'and R 5'-CCTTTCTTCTGGGCTGAGAC-3'，NCBI 序 號102 552664；LncRNA-CHRF，5'-CCUGCCUUGUAUUUUGUGUUG-3' and 3'-CAACACAAAATACAAGGCAGG-5'，NCBI

圖1 不同濃度Ang度誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞肥大能力

序號105 463121；GAPDH：5'-GCAAGAGAGAGGCCCTCAG-3'and 5'-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3'。

1.3.4 Western blotting 檢測自噬相關(guān)信號通路p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/GAPDH、P62/GAPDH蛋白表達(dá)

收集心肌細(xì)胞后，加入100 μl 裂解緩沖液，冰水浴置2 h，期間輕搖振蕩。然后于4℃，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液。應(yīng)用Bradford 法檢測蛋白濃度。每孔上樣50 μg，滴加SDS 緩沖液，加熱至沸點約5 min，在通過含有10% SDS-聚丙烯酰胺的凝膠電泳而分離蛋白質(zhì)，將分離的蛋白轉(zhuǎn)印到NC 膜，并將Tris緩沖鹽溶液沖脫脂奶粉稀釋至5%濃度封閉液，在25℃下封閉2 h，再加入相應(yīng)抗體（1∶700）于4℃孵育放置12 h，用Tris 緩沖鹽溶液反復(fù)洗膜3 次，最后滴入相應(yīng)過氧化物酶印記的羊抗兔IgG 二抗（1∶4 000），在25℃下放置1 h，重復(fù)上述洗膜過程3 次，每次10 min。組后用ECL 發(fā)光顯色，使用凝膠成像儀進(jìn)行拍攝、描繪并進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白與β光顯色，使用的吸光度比值表示目的基因在蛋白水平的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS19軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s），多組間均數(shù)的比較采用One-way ANOVA分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)H9C2 心肌細(xì)胞肥大能力與濃度正相關(guān)

用濃度梯度（0、10-8、10-7、10-6mol·L-1）的AngⅡ處理H9C2 心肌細(xì)胞，48 h 后用熒光顯微鏡觀察免疫熒光染色下心肌細(xì)胞變化情況。結(jié)果如圖1所示：AngⅡ處理的H9C2 心肌細(xì)胞的細(xì)胞核與表面積增大，且這種改變與AngⅡ的濃度有劑量相關(guān)性，以10-6mol·L-1濃度的AngⅡ誘導(dǎo)能力最強(qiáng)（故后續(xù)實驗我們均采用10-6mol·L-1的AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大）。

2.2 小檗堿逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大具有濃度依賴性

用不同濃度（0.5、5、50 μmol·L-1）小檗堿處 理H9C2 心肌細(xì)胞肥大模型（濃度為10-6mol·L-1的AngⅡ誘導(dǎo)），48 h后熒光顯微鏡觀察免疫熒光染色下心肌細(xì)胞變化情況。結(jié)果如圖2 所示，隨著小檗堿濃度的增加，心肌細(xì)胞核與表面積逐漸縮小。這證明小檗堿可以逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大，且這種作用與小檗堿的濃度正相關(guān)。

2.3 H9C2 心肌細(xì)胞肥大模型LncRNA-MIAT 表達(dá)增加，小檗堿處理后LncRNA-MIAT的表達(dá)下調(diào)

為了增加實驗的成功率，我們選擇了兩條目標(biāo)LncRNA（LncRNA-MIAT、cardiac hypertrophy-related factor,LncRNA-CHRF），然后用qPCR 技術(shù)對心肌細(xì)胞進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖3、圖4 所示：上述2 條lncRNA在肥大的心肌細(xì)胞中均出現(xiàn)過表達(dá)，與正常的H9C2心肌細(xì)胞相比，其LncRNA-MIAT、LncRNA-CHRF 數(shù)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），因此，可認(rèn)為LncRNA-MIAT、LncRNA-CHRF 可能是潛在的導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大的基因靶點。在用不同濃度（0.5、5、50 μmol·L-1）的小檗堿處理后，與心肌細(xì)胞肥大模型組相比，LncRNA-MIAT和LncRNA-CHRF的表達(dá)均出現(xiàn)有意義的下調(diào)（P＜0.05），且以LncRNA-MIAT 表達(dá)差異最為顯著（P＜0.01），并且LncRNA-MIAT 的表達(dá)水平與小檗堿的給藥濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系（后續(xù)實驗均使用50 μmol·L-1小檗堿）；因此，我們認(rèn)為小檗堿通過下調(diào)LncRNA-MIAT 的表達(dá)是其抑制心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制之一。

圖2 不同濃度小檗堿逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大能力

圖3 lncRNA-MIAT表達(dá)情況

圖4 lncRNA-CHRF表達(dá)情況

2.4 干擾LncRNA-MIAT后心肌細(xì)胞肥大出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)

進(jìn)一步驗證LncRNA-MIAT 與心肌細(xì)胞肥大的關(guān)系，用siRNA 技術(shù)干擾H9C2 心肌細(xì)胞肥大模型，免疫熒光染色后用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖5 所示：siModel 組與NC 組比較，心肌細(xì)胞細(xì)胞核與表面積均明顯增大，而siMAIT 組與siModel 相比，心肌細(xì)胞細(xì)胞核與表面積明顯縮小。這進(jìn)一步證明了LncRNAMIAT 可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，干擾LncRNA-MIAT 功能后心肌細(xì)胞肥大可出現(xiàn)一定程度逆轉(zhuǎn)。

2.5 沉默LncRNA-MIAT 后H9C2 心肌細(xì)胞自噬活性增加

用Western blot 檢測自噬通路相關(guān)蛋白p-AMPK/AMPK、LC3II/GAPDH、P62/GAPDH 比率。結(jié)果如圖6所 示：siModel 組 與BBR 組比較，p-AMPK/AMPK、LC3II/GAPDH 比值縮小，P62/GAPDH 比值增大，提示心肌肥大時自噬活性減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；圖C 中，siRNA-MIAT 組與BBR 組比較，siRNAMIAT 組P62/GAPDH 比值下調(diào)（P＜0.05），與siModel組比較，siRNA-MIAT 組P62/GAPDH 比值顯著下調(diào)（P＜0.01），均具有統(tǒng)計學(xué)差異。在圖D、E 中，siRNAMIAT 組與BBR 組及siModel 組比較，質(zhì)粒siRNAMIAT 轉(zhuǎn)染后p-AMPK/AMPK、LC3II/GAPDH 比值出現(xiàn)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。qPCR技術(shù)檢測LncRNA-MIAT 表達(dá)水平，結(jié)果如B 所示：siRNA-MIAT 組 及BBR 組與siModel 組比較LncRNAMIAT表達(dá)量明顯下調(diào)（P＜0.01）。這提示心肌細(xì)胞肥大時細(xì)胞自噬活性減弱，下調(diào)LncRNA-MIAT 能改變AMPK、LC3Ⅱ、P62的活性增強(qiáng)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大細(xì)胞自噬，小檗堿抑制心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制可能是其通過下調(diào)LncRNA-MIAT 的表達(dá)增強(qiáng)自噬活性實現(xiàn)的。

圖5 siRNA技術(shù)干擾后的心肌細(xì)胞肥大情況

圖6 Western blot檢測p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/GAPDH表達(dá)水平

圖7 AngⅡ模擬的壓力信號上調(diào)了LncRNA-MIAT表達(dá)，作用于AMPK、LC3II、P62，使細(xì)胞自噬下降，心肌細(xì)胞的細(xì)胞核與表面積增大；小檗堿在壓力負(fù)荷增加情況下，通過下調(diào)Ln?cRNA-MIAT，使AMPK、LC3II活性增加，P62活性降低，進(jìn)而使心肌細(xì)胞自噬增強(qiáng)，心肌細(xì)胞的細(xì)胞核和表面積縮小。

3 討論

心肌肥大是心肌細(xì)胞在外界刺激下所做出的代償反射，當(dāng)這種代償?shù)搅艘欢A段，心臟就會出現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能的改變，表現(xiàn)為心室重塑和心功能下降，因此深入去探討心肌肥大的病理機(jī)制與基因靶點，研究和開發(fā)抑制心肌肥大的新藥物與治療手段，對于心衰防治具有重要意義。人們對心衰治療的探索幾經(jīng)波折，目前的治療旨在改善衰竭心臟的生物學(xué)特性，應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、β受體阻滯劑等在內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌抑制劑拮抗心室重構(gòu)，以降低心衰的病死率和住院率[8]。當(dāng)前一種新藥沙庫巴曲/纈沙坦（血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑）被歐洲心臟病協(xié)會及加拿大心血管病協(xié)會新指南推薦用于心衰治療，在降低心衰死亡和住院風(fēng)險方面，被認(rèn)為有優(yōu)于依那普利的治療效果，給心衰治療帶來新希望，但是其長期使用的安全性和療效的穩(wěn)定性仍然需要臨床實踐的檢驗[9,10]。而中醫(yī)藥經(jīng)過長期臨床積累，發(fā)現(xiàn)部分方藥確能治療心力衰竭，展現(xiàn)出了價廉效優(yōu)、毒副作用小的獨特優(yōu)勢。其中一種歸屬于毛茛目的草本植物，其根莖入藥就是傳統(tǒng)中藥黃連，具有清利濕熱，瀉火解毒的功效，通過不同炮制方法，黃連功效側(cè)重點不同，酒制善清上焦火熱，姜制善清胃止嘔，萸制則舒肝和胃?！侗静萁?jīng)解》謂其：味苦無毒，得地南方之火味，入手少陰心經(jīng)，氣味俱降，陰也。所以善清心火，治心病[11]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其治病的主要成分就是小檗堿。小檗堿具有抑菌、抗血小板、降糖、降壓、拮抗心室重構(gòu)、保護(hù)心肌等多種作用[12,13]，有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對于正常的H9C2 心肌細(xì)胞無影響，但在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞中，細(xì)胞的活力隨著小檗堿的給藥劑量的增加而增加[14]。我們的研究用不同濃度的小檗堿處理H9C2心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小檗堿可以逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大，且小檗堿抑制心肌細(xì)胞肥大的作用具有濃度依耐性的特點。

LncRNA 是一類長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA，具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子激活等多種生物學(xué)功能。近年來，LncRNA 與心衰的關(guān)系是臨床研究熱點。其在心衰應(yīng)用中的巨大潛力在于：它一方面可能成為一種高敏感、高特異性檢測心衰的生物學(xué)標(biāo)志。例如，有學(xué)者檢測了心衰小鼠的心臟、血漿及全血中LncRNA 的變化,發(fā)現(xiàn)有32 組LncRNA 存在特征性表達(dá),并認(rèn)為LncRNA 可能成為心衰的潛在生物標(biāo)志物[15]。另一方面，LncRNA 在分子水平上有著強(qiáng)大的調(diào)控力，可以調(diào)控細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)并進(jìn)一步影響疾病發(fā)展，其作為藥物靶點的臨床運用潛力巨大。Viereck J 在小鼠心衰模型與主動脈狹窄所致的心衰患者中均發(fā)現(xiàn)LncRNA-Chast 顯著表達(dá)，在沉默Chast后,小鼠心室重構(gòu)情況得到改善[4]。Tao H 等人的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA 在包括心肌纖維化等多種疾病中表達(dá)，通過上調(diào)LncRNA-GAS5 可以負(fù)向調(diào)控miR-21 的表達(dá)，從而抑制心肌纖維化，改善心室重構(gòu)[16]。我們的研究通過qPCR 技術(shù)證實了LncRNA-MIAT 在肥大的心肌細(xì)胞模型中表達(dá)增加，用siRNA 技術(shù)干擾LncRNAMIAT 后，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，證明其能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。進(jìn)一步研究用小檗堿處理肥大的心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LncRNA-MIAT 表達(dá)下調(diào)，心肌細(xì)胞肥大情況改善，這表明小檗堿可以通過下調(diào)LncRNAMIAT的表達(dá)抑制心肌細(xì)胞肥大。

自噬是細(xì)胞器及細(xì)胞內(nèi)容物利用溶酶體被降解過程的統(tǒng)稱，生理狀態(tài)下，細(xì)胞自噬處于較低水平，其目的在于清除衰老受損的細(xì)胞器；在病理狀態(tài)下，自噬會顯著激活，在穩(wěn)定細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞正常生理功能方面起著重要作用。自噬水平的調(diào)節(jié)受自噬基因和蛋白的控制，AMPK 是生物能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)激酶，LC3Ⅱ是哺乳動物細(xì)胞自噬的標(biāo)記蛋白之一，其可以通過泛素樣修飾作用定位于自噬小體中，其含量的高低與自噬水平呈正相關(guān)關(guān)系[17]。研究發(fā)現(xiàn)AMPK 激活促進(jìn)了下游自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ的激活，使心肌細(xì)胞逐漸適應(yīng)慢性缺氧等病理狀態(tài)[18-19]。P62 是LC3 下游的結(jié)合蛋白，可以看做是自噬的降解底物，其含量高低與自噬水平負(fù)相關(guān)[20]。心肌肥大與自噬關(guān)系密切,經(jīng)敲除自噬相關(guān)基因Atg5和Atg7,在血管緊張素Ⅱ和異丙腎上腺素誘導(dǎo)的壓力超負(fù)荷動物模型中，自噬受到抑制，明顯加速心肌肥大及心衰的進(jìn)程[21-22]。我們對比了心肌細(xì)胞肥大模型和用小檗堿、干擾質(zhì)粒siRNA-MIAT 處理的心肌細(xì)胞肥大模型中自噬通路的標(biāo)志蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，經(jīng)小檗堿、干擾質(zhì)粒siRNA-MIAT 處理的模型組的p-AMPK/AMPK、LC3II/GAPDH 比值增加，P62/GAPDH比值下降，這表明LncRNA-MIAT 使AMPK、LC3Ⅱ的活性下降，P62 活性增加，進(jìn)而使心肌細(xì)胞自噬減弱，這種作用經(jīng)沉默LncRNA-MIAT 或使用小檗堿干預(yù)后出現(xiàn)一定程度逆轉(zhuǎn),表明小檗堿抑制心肌細(xì)胞肥大的作用，可能是其通過下調(diào)LncRNA-MIAT 的表達(dá),使AMPK、LC3Ⅱ活性增加、P62 活性下降而促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬實現(xiàn)的。這種機(jī)制總結(jié)如圖7。

綜上所述，我們初步探明了小檗堿/LncRNAMIAT/AMPK/LC3Ⅱ/P62/心肌細(xì)胞肥大之間的關(guān)系。因此我們認(rèn)為小檗堿下調(diào)LncRNA-MIAT 的表達(dá)水平抑制心肌細(xì)胞肥大，與其增加AMPK、LC3Ⅱ的活性，減弱P62 活性,進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬逆轉(zhuǎn)心肌肥大，這可能是小檗堿治療心衰有效的主要機(jī)制之一，對中醫(yī)探索新的方法治療心衰具有重要意義。然而多種LncRNA 與心肌肥大存在關(guān)系，自噬過程也受多個基因調(diào)控。但是限于條件與經(jīng)費所限，我們并沒有深入去挖掘是否存在其它LncRNA 在小檗堿抑制心肌肥大的過程中出現(xiàn)有意義的表達(dá)，也沒有進(jìn)一步探討更多的自噬基因與這些LncRNA 的關(guān)系。下一步的實驗我們將對其做進(jìn)一步探討。