江茂瓊，賈鈺銘，李 婷，邱 野，江 健，江玉蘭，葉文靜

四川省宜賓市第二人民醫(yī)院腫瘤科(宜賓644000)

肺癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，每年全球新確診肺癌患者約160萬[1]，其病死率位居各惡性腫瘤中首位，雖然近年來肺癌的生存率有所提高，但5年生存率僅為16%左右[2]，嚴重威脅患者的生命安全。肺癌的發(fā)病機制尚無明確，相關研究報道[3]，機體正常的免疫應答狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。在機體抗腫瘤免疫中，CD4+和CD8+T細胞介導的細胞免疫應答發(fā)揮主要作用[4]。CD8+T細胞主要通過釋放細胞毒性物質(zhì)如穿孔素、顆粒酶等對腫瘤細胞產(chǎn)生直接殺傷作用，而CD4+T細胞除本身具有直接殺傷腫瘤細胞的作用，同時可通過分泌Th1型細胞因子，從而對CD8+T細胞、NK細胞及巨噬細胞等殺傷腫瘤細胞。骨髓源性抑制細胞(Myeloid-derived suppressorcells，MDSCs)是一群未成熟的異質(zhì)性骨髓細胞，其主要由樹突狀細胞、巨噬細胞及粒細胞的祖細胞或前體細胞組成[5]。研究證實[6]在腫瘤微環(huán)境下MDSCs水平表達顯著上調(diào)，具有抑制抗腫瘤免疫的作用，且剔除MDSCs，去除其抑制作用或誘導MDSCs轉(zhuǎn)化為樹突狀細胞可能在目前治療腫瘤的相關研究中具有一定現(xiàn)實意義。目前較多關于肺癌小鼠免疫器官MDSCs和CD8+T細胞的比例的研究，而關于MDSCs對肺癌小鼠CD8+T細胞及生存期的影響仍較少，筆者就此展開報道，現(xiàn)總結如下。

材料和方法

1 材 料

1.1 實驗動物和細胞：選取6～8周雌性C57BL/6小鼠，共15只，體重18～20 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。Lewis肺癌細胞LLC細胞購自上海研生實業(yè)有限公司研究所，LLC細胞培養(yǎng)采用DMEM-F12培養(yǎng)基加10%胎牛血清。培養(yǎng)條件：37℃、5% CO2、飽和濕度，間隔3d當細胞達到約90%融合時，采用胰蛋白酶-EDTA(0.25%)消化傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器：Gr-1刪除抗體、PE標記的Gr-1抗體、FITC標記的CD11b抗體、CD3-PE/CY7、CD8-PE。流式細胞儀購自艾森生物(杭州)有限公司。

2 實驗方法

2.1 動物實驗：消化收集Lewis肺癌細胞LLC細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后行臺盼藍染色使細胞活力>95%，細胞計數(shù)。采用PBS調(diào)整濃度至1×107個/ml并混合均勻，而后于雌性C57小鼠背部行皮下接種，每只接種100μl×106個，制作Lewis肺癌模型。選取腫瘤大小符合規(guī)定(腫瘤直徑約3～6mm)的小鼠12只，采用隨機數(shù)字表法分為對照組(6只)和觀察組(6只)。對照組小鼠尾靜脈注射100μg兔IgG，觀察組小鼠尾靜脈注射Gr-1抗體或?qū)φ湛贵w以刪除荷瘤小鼠血液中的MDSC。分別于注射抗體注射后第3天、7天及10天留取血液并行細胞檢測。間隔3～4d行腫瘤直徑測量，計算公式：v=0.52×a×b×b。同時記錄荷瘤小鼠的生存時間。

2.2 流式細胞儀檢測：將荷瘤小鼠尾巴在規(guī)定的時間減去一小段，留取約20μl血液，紅細胞裂解完成后將白細胞濃度調(diào)整為1×107/ml，檢測MDSCs并用Gr-1-PE和CD11b-FITC標記染色，采用CD8-PE和CD3-PE/CY7對CD8+T細胞進行標記染色，檢測儀器為流式細胞儀。數(shù)據(jù)分析采用FlowJo 7.6軟件。

結果

1 皮下肺癌小鼠模型制備 15只小鼠行皮下接種LLC細胞，制作Lewis肺癌模型。8d后腋下開始出現(xiàn)可觸及的腫瘤的小鼠共12只，成瘤率達80.00%(12/15)。15 d后小鼠腋下腫瘤明顯增大，22d可見小鼠的整個腋窩幾乎全為腫瘤，腫瘤體積可達(6512.8±845.985)mm3。

2 荷瘤小鼠外周血中MDSC和CD8+T細胞的變化 注射Gr-1前兩組荷瘤小鼠外周血中MDSC和CD8+T細胞比例無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；注射Gr-1第3天，觀察組MDSC比例為(1.58±0.30)，顯著低于對照組(38.35±3.22)，CD8+T細胞比例為(9.47±0.83)，顯著高于對照組(4.23±0.47)；注射Gr-1第10天，MDSC比例為(31.95±3.60)，顯著低于對照組(63.67±5.77)，CD8+T細胞比例為(5.82±0.56)，顯著高于對照組(2.88±0.34)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 荷瘤小鼠外周血中MDSC和CD8+T細胞變化

3 C57小鼠荷瘤注射不同抗體后腫瘤生長曲線 如圖1所示，在荷瘤小鼠腫瘤生長25d左右，隨著抗體的代謝消除，兩組腫瘤大小差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 C57小鼠荷瘤注射不同抗體后腫瘤生長曲線

4 C57小鼠荷瘤注射不同抗體后的生存曲線 如圖2所示，觀察組小鼠生存率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 C57小鼠荷瘤注射不同抗體后的生存曲線

討 論

隨著老齡化進程的加快及空氣污染的加重，目前肺癌發(fā)病人數(shù)呈逐年上升的趨勢，故目前關于肺癌的發(fā)生發(fā)展及腫瘤免疫應答方面的研究已成為科研熱點。腫瘤患者機體免疫功能與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關，其中自然殺傷T細胞及MDSCs是兩種重要免疫調(diào)節(jié)細胞亞群[7]，自然殺傷T細胞(Natural killer T cells，NKT)表面既表達NK細胞表面的標志物CD56，又表達T細胞的表面標志物TCR-CD3，NKT細胞可識別海綿由CD1-d提呈的脂類抗原，能夠在激活狀態(tài)下產(chǎn)生Th1及Th2細胞進而產(chǎn)生IFN-γ、IL-4等細胞免疫因子，發(fā)揮調(diào)控細胞免疫及體液免疫的作用，免疫抑制目前是腫瘤免疫應答研究的熱點項目，文獻顯示[8]，MDSCs、Treg及INKT細胞是目前與免疫抑制相關的細胞群，而近年來被發(fā)現(xiàn)具有強大負調(diào)控作用的MDSCs細胞已被證實與肺癌患者疾病發(fā)展密切相關，其能抑制抗CD3抗體及多種絲裂原誘導的T細胞增殖，同時抑制同種抗原劑NKT細胞活性，其同時具有固有免疫應答及抑制適應性免疫應答的作用[9]。目前關于肺癌細胞的逃逸機制相關研究表明[10]，免疫逃逸不僅與腫瘤抗癌調(diào)變、MCH及共刺激因子表達降低有關，此外由腫瘤導致的機體免疫功能降低也是重要相關因素。目前研究顯示[11]，CD8+T細胞可通過表達死亡受體FasL及釋放顆粒酶/穿孔素發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的功能，而CD4+T細胞可通過分泌IL-12、IL-2及IFN-γ等細胞因子間接誘導自然殺傷細胞、巨噬細胞及細胞毒性細胞對腫瘤細胞的直接殺傷作用。目前研究顯示[12]，當LLC細胞接種小鼠機體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤細胞的同時，其外周淋巴組織如脾臟、外周淋巴結等可出現(xiàn)CD8+及CD4+T細胞的比例降低，荷瘤小鼠脾臟及淋巴結腫大，導致細胞總數(shù)增加，故腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，抑制機體免疫應答是導致的效應T細胞數(shù)量的降低的關鍵所在。

MDSCs細胞為髓系來源的由未成熟的骨髓細胞、巨噬細胞、樹突細胞、單核巨噬細胞及處于低分化期的其他骨髓細胞組成的異質(zhì)性細胞[13]。目前研究表明[14]，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的如干細胞因子(Stem cell factor，SCF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte / Macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)等炎性因子均可促進MDSCs的形成，此外還能促進MDSCs擴增遷移至外周血、外周淋巴器官及腫瘤微環(huán)境中，抑制NK細胞、巨噬細胞、NK-T細胞、T細胞等多種免疫細胞的抗腫瘤效應。目前文獻報道[15]，在荷瘤小鼠中，MDSCs特征性表達Gr1+CD11b+。而有研究指出[16]，多種動物模型及腫瘤人群中都發(fā)現(xiàn)MDSCs具有顯著免疫抑制作用，并對腫瘤增長具有促進作用，其主要機制較為復雜。除與腫瘤組織微血管形成有關外，還與T細胞、Treg細胞、B細胞等具有聯(lián)系，可阻止上述細胞發(fā)揮細胞免疫相關功能，并誘導產(chǎn)生利于腫瘤生長的微環(huán)境，對腫瘤細胞的增殖遷移產(chǎn)生促進作用。

隨著研究的不斷深入，有學者指出對于效應T細胞識別及殺傷腫瘤細胞的是宿主抗原提呈細胞，而MDSCs作為樹突狀細胞及巨噬細胞前體，也具有抗原提呈作用，但與正?？乖岢始毎麊舆^程相反，MDSCs主要通過以下機制參與腫瘤抗原的細胞免疫耐受[17]：①正常狀態(tài)下MDSCs能夠表達高水平精氨酸酶，可分解周圍環(huán)境中T細胞活化必須的精氨酸，影響CD8+及CD4+T細胞的活化過程；②產(chǎn)生一氧化氮合酶及活性氧，導致效應T細胞增殖受阻；③下調(diào)T細胞受體相關ζ鏈，導致效應T細胞活化信號無法傳遞；④產(chǎn)生膜結合性TGF-β通過直接與T細胞接觸的方式抑制其活性；⑤通過下調(diào)CD62L分子的表達，使naiveT細胞無法歸巢，影響naiveT細胞遷移至腫瘤組織的過程，進而使已經(jīng)活化的CD8+及CD4+T細胞數(shù)量減少。目前較多研究MDSCs在肺癌小鼠中的表達水平，但關于其對CD8+T細胞及荷瘤小鼠生存期方面的研究較少。正常情況下，MDSCs主要存在于小鼠骨髓中，外周淋巴器官含量較少，筆者查閱相關文獻，MDSCs在正常小鼠中外周血含量約為7.5%[18]，在本次研究中，注射Gr-1前1d時觀察組荷瘤小鼠其外周血MDSCs含量為(23.86±1.34)，而注射后第3天，MDSCs含量迅速降低，與此同時CD8+含量達到較高水平，隨著時間的延長，在注射后第10天，觀察組MDSCs含量雖明顯低于對照組，但其效果已經(jīng)大大減弱。就MDSCs水平逐漸回升，我們認為與腫瘤細胞增殖過程中產(chǎn)生的多種細胞因子有關，SCF、GM-CSF、IL-6等均能誘導MDSCs的形成，使原本主要存在于骨髓的MDSCs大量分布于外周血當中。

本研究結果顯示，在荷瘤小鼠腫瘤生長25d左右，兩組腫瘤大小比較差異無統(tǒng)計學意義，而生存期統(tǒng)計結果顯示，觀察組小鼠生存期顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，說明注射抗體對于改善生存期意義較大，對腫瘤生產(chǎn)抑制作用較為有限，故我們認為高水平MDSCs能夠降低CD8+水平，對生存期有較大影響，隨著時間的延長，注射MDSCs抗體無法降低腫瘤生長速度。