黎裕明，雷愛楓，王春梅，戴海，龐俊峰，劉會(huì)江，黃宗貴*

(1.南寧市第一人民醫(yī)院骨科，廣西 南寧 530001；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉手術(shù)科，廣東 廣州 510080；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院東院麻醉手術(shù)科，廣東 廣州 510700)

腰背痛(low back pain，LBP)一直是困擾人類生活與工作的常見疾患之一，流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)超過(guò)80%的人在其一生中會(huì)經(jīng)歷長(zhǎng)達(dá)4周以上的腰痛[1]，目前公認(rèn)腰痛的主要病因?yàn)樽甸g盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)及其繼發(fā)的一系列疾病[2]。椎間盤退變的病理生理學(xué)主要表現(xiàn)為髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells，NPCs)的減少、細(xì)胞外基質(zhì)的改變以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)[3]。髓核細(xì)胞參與合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，是維持椎間盤正常生理功能的關(guān)鍵細(xì)胞。[4-5]。如何維持髓核細(xì)胞數(shù)量及分泌細(xì)胞外基質(zhì)功能是治療椎間盤退變的根本措施。脂聯(lián)素(adiponectin，Apn)是由脂肪細(xì)胞分泌的一種激素蛋白，研究證實(shí)Apn除具有抗炎、抗氧化等功能外，還能調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡[6-7]。椎間盤退變進(jìn)程中，髓核細(xì)胞增殖下降、凋亡增加，Apn能否調(diào)控髓核細(xì)胞增殖凋亡進(jìn)程尚未清楚。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Apn對(duì)人髓核細(xì)胞的調(diào)控作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 髓核組織獲取及細(xì)胞培養(yǎng) 人髓核細(xì)胞購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?貨號(hào)4800 sciencell)，培養(yǎng)方法依照Risbud等[8]文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞傳代至3～5代用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試劑耗材 人全長(zhǎng)Apn(Catalog no.1065-AP；R&D公司)，MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，Adipo R1抗體(ab189446 44 kDa，Abacm公司)、Adipo R2抗體(ab126611 43 kDa，Abacm公司)，β-Tubulin Antibody抗體(#2146，CST公司)，CCK8試劑盒(Catalog no.C0038；碧云天公司)，TUNNEL試劑盒(Catalog no.12 156 792 910；Roche公司)，慢病毒LV-sh Adipo R1和LV-sh Adipo R2(購(gòu)自百恩維生物)。

1.3 細(xì)胞處理 培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，使用腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)(50 μg/mL)刺激髓核細(xì)胞，刺激0、12、24、48及72 h后中斷反應(yīng)，CCK8檢測(cè)TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞增殖的影響，TUNEL和流式細(xì)胞儀檢測(cè)TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響。

離體培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，使用不同濃度Apn聯(lián)合TNF-α處理細(xì)胞，分為四組：Ctr(對(duì)照組)、TNF-α(50μg/mL)組、TNF-α(50μg/mL)+Apn(1μg/mL)組和TNF-α(50 μg/mL)+Apn(5 μg/mL)組處理細(xì)胞，處理0、12、24、48及72 h后中斷反應(yīng)，CCK8檢測(cè)TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞增殖的影響，TUNEL和流式細(xì)胞儀檢測(cè)TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響。

為了進(jìn)一步明確脂聯(lián)素受體在Apn調(diào)控髓核細(xì)胞增殖凋亡中的作用，構(gòu)建慢病毒Adipo R1、Adipo R2基因沉默載體Lv-sh-Adipo R1/R2。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)髓核細(xì)胞中Adipo R1、Adipo R2的基因沉默情況以確保Adipo R1、Adipo R2表達(dá)下降80%以上；檢測(cè)人髓核細(xì)胞中Adipo R1、Adipo R2基因沉默后，TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞增殖凋亡的誘導(dǎo)情況：病毒轉(zhuǎn)染人髓核細(xì)胞5d后加入TNF-α誘導(dǎo)，處理0、12、24、48及72 h后中斷反應(yīng)，CCK8檢測(cè)TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞增殖的影響，TUNNEL和流式細(xì)胞儀檢測(cè)TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響。

1.4 Western blot檢測(cè) 微量二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測(cè)蛋白濃度。取20 μg蛋白樣本、配置10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，PVDF膜將分離后蛋白轉(zhuǎn)印紙膜上，3% BSA室溫封閉1 h，cleaved-Caspase-3/8(1︰2 000)一抗4℃搖床孵育過(guò)夜，室溫二抗孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence)發(fā)光液孵育并曝光。

1.5 TUNEL實(shí)驗(yàn) 消化生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，依據(jù)說(shuō)明書將人髓核細(xì)胞以1×105/mL加入96孔板，分別給予不同分組刺激后，移除上清液并無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，配置TUNEL孵育液并加入髓核細(xì)胞中孵育1 h，棄去TUNEL并PBS清洗一遍，加入DAPI(1 μg/mL)避光孵育15min，加入抗熒光淬滅液。最后熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

1.6 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 依據(jù)說(shuō)明書將人髓核細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板，分別給予不同分組刺激后，移除上清液并PBS清洗，胰酶消化細(xì)胞、血清終止，離心后重新懸浮清洗細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105～1×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式細(xì)胞管中，加入Annexin V-FITC 5μL和10 mg/L碘化丙啶10 μL，混勻后室溫避光孵育15 min，加入400 μL稀釋好的結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 Lv-sh-Adipo R1/R2感染髓核細(xì)胞及驗(yàn)證 人髓核細(xì)胞感染Lv-sh-Adipo R1/R2慢病毒后，轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡顯示髓核細(xì)胞激發(fā)出大量綠色熒光；RT-PCR及Western Blot檢驗(yàn)結(jié)果顯示髓核細(xì)胞內(nèi)Adipo R1/R2 mRNA表達(dá)顯著下降，提示基因沉默成功，見圖1～6。

圖1 Lv-sh-Adipo R1組髓核細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果

注：*組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

注：*組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

圖4 Lv-sh-AdipoR2組髓核細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果

注：*組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

注：*組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

2.2 Apn對(duì)人髓核細(xì)胞增殖的影響 離體培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，使用不同濃度Apn聯(lián)合TNF-α處理細(xì)胞，處理0、24、48及72 h后中斷反應(yīng)，CCK8檢測(cè)TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α抑制人髓核細(xì)胞增殖，Apn能夠拮抗TNF-α對(duì)人髓核細(xì)胞增殖的抑制作用，并且呈劑量效應(yīng)(見圖7)。

圖7 Apn對(duì)人髓核細(xì)胞增殖的影響

2.3 Apn對(duì)人髓核細(xì)胞凋亡的影響 采用上述組別處理人髓核細(xì)胞，處理12h后收集細(xì)胞采用TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡，另采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示TNF-α促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡，Apn能夠拮抗TNF-α對(duì)人髓核細(xì)胞的促凋亡作用(見圖8)。

2.4 Adipo R1/R2對(duì)髓核細(xì)胞增殖凋亡的影響 應(yīng)用慢病毒技術(shù)沉默髓核細(xì)胞內(nèi)Adipo R1/R2后，再給予TNF-α刺激髓核細(xì)胞，CCK8檢測(cè)Adipo R1/R2對(duì)髓核細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)TNF-α抑制人髓核細(xì)胞增殖，沉默Adipo R1/R2能夠增強(qiáng)TNF-α對(duì)人髓核細(xì)胞增殖的抑制作用(見圖9)。

a TUNNEL檢測(cè)結(jié)果

注：*組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

c 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

注：*組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

圖9 Adipo R1/R2對(duì)髓核細(xì)胞增殖凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)Adipo R1/R2對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示TNF-α促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡，沉默Adipo R1/R2能夠增強(qiáng)TNF-α對(duì)人髓核細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用(見圖10)。

a 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

注：*組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

3 討 論

椎間盤退變是一個(gè)與年齡密切相關(guān)的病理生理學(xué)過(guò)程，其典型特征為髓核組織正常結(jié)構(gòu)喪失和進(jìn)行性纖維化；髓核組織是椎間盤行使生物力學(xué)功能的中心，其形態(tài)及理化性質(zhì)的改變是椎間盤退變的主要病理學(xué)改變[7]。導(dǎo)致以上病理改變的主要原因包括兩大方面：髓核細(xì)胞數(shù)量減少和功能下降[8]。髓核細(xì)胞合成、分泌的細(xì)胞外基質(zhì)是椎間盤髓核組織的主要組成部分。髓核細(xì)胞的數(shù)量減少(如NPCs凋亡及細(xì)胞增殖功能減低)與功能下降(如蛋白多糖、Ⅱ型膠原的合成減少)直接導(dǎo)致了髓核組織的各種病理學(xué)改變[9]。此外，退變椎間盤的髓核還產(chǎn)生多種炎性因子和參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶與水解酶，如白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、TNF-α、去整合素和金屬蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、氧自由基等，加速細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝，最終導(dǎo)致椎間盤的退變[10-11]。

脂聯(lián)素(adiponectin，Apn)是由脂肪細(xì)胞分泌的一種激素蛋白，多項(xiàng)研究證實(shí)Apn具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等功用[12]。研究發(fā)現(xiàn)Apn能夠通過(guò)兩個(gè)受體Adipo R1、Adipo R2抑制髓核細(xì)胞合成分泌疼痛介質(zhì)前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE-2)，提示Apn可能為一個(gè)保護(hù)性因子，在椎間盤源性腰痛環(huán)境中發(fā)揮抗炎作用[13]。Terashima等[14]研究發(fā)現(xiàn)Adipo R1、Adipo R2在椎間盤退變進(jìn)程中呈下降趨勢(shì)，Apn能抑制IL-1β對(duì)髓核細(xì)胞合成分泌TNF-α的促進(jìn)作用，提示Apn參與了椎間盤退變的進(jìn)程。Yuan等[15]報(bào)道退變椎間盤內(nèi)Apn表達(dá)下降，外源性Apn能抑制退變椎間盤髓核細(xì)胞合成分泌TNF-α、并且呈劑量時(shí)間依賴性，提示Apn通過(guò)下調(diào)髓核細(xì)胞合成分泌TNF-α從而發(fā)揮其抗炎作用。然而目前尚不清楚Apn能否調(diào)控髓核細(xì)胞增殖凋亡進(jìn)程。

研究證實(shí)Apn除具有抗炎、抗氧化等功能外，還能調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，并且其功能具有細(xì)胞組織特異性[4-5]。Dieudonne等[16]研究發(fā)現(xiàn)Apn能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞周期從而抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖。Rakatzi等[17]發(fā)現(xiàn)Apn在胰島B細(xì)胞中具有抗凋亡作用，能對(duì)抗炎癥因子和脂肪酸對(duì)胰島B細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)。DiMascio等[18]研究發(fā)現(xiàn)Apn和其受體Adipo R1/2在造血干細(xì)胞中均有表達(dá)，Apn能促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)Adipo R1/2表達(dá)與海馬神經(jīng)干細(xì)胞，Apn能促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖、并呈時(shí)間劑量依賴性，卻不影響神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡和分化功能。付宗杰等[20]研究發(fā)現(xiàn)Apn可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，并減少缺氧、缺糖損傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡。以上研究證實(shí)Apn廣泛參與了各個(gè)細(xì)胞系的增殖凋亡進(jìn)程，并且具有細(xì)胞差異性。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α能抑制髓核細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)髓核凋亡，脂聯(lián)素能逆轉(zhuǎn)TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用(P<0.05)。Adipo R1/2沉默后，髓核細(xì)胞增殖受到抑制、凋亡升高，其中以Adipo R2為著(P<0.05)。此外，Adipo R1/2沉默能增強(qiáng)TNF-α對(duì)髓核細(xì)胞cleaved-Caspase-3/8的誘導(dǎo)作用。

綜上所述，本研究通過(guò)慢病毒基因沉默等試驗(yàn)手段發(fā)現(xiàn)Apn能夠通過(guò)兩個(gè)受體Adipo R1、Adipo R2參與髓核細(xì)胞增殖凋亡進(jìn)程，Apn促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖和抑制髓核細(xì)胞凋亡，提示Apn可能作為一個(gè)保護(hù)性因子在椎間盤退變進(jìn)程中發(fā)揮抗凋亡作用。因此，接下來(lái)可以通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)深入了解Apn在椎間盤退變中的作用及相關(guān)機(jī)制。