張瑞濤，史惠蓉，任 芳，劉哲穎，姬鵬程

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，鄭州 450052

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，手術(shù)和化療是臨床治療卵巢癌患者的主要手段，缺乏早期診斷手段、易于產(chǎn)生鉑類藥物化療耐藥是卵巢癌患者預(yù)后不良的主要原因，導(dǎo)致其死亡率高居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位[1- 2]。因此，尋找具有抗腫瘤活性的傳統(tǒng)中藥材和植物提取物可為卵巢癌患者的臨床治療提供新的選擇。二烯丙基二硫化物(diallyl disulfide，DADS)是大蒜主要的脂溶性有效成分之一，研究表明DADS對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞，如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌、白血病等腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致細(xì)胞周期G2/M期阻滯等[3- 9]。細(xì)胞內(nèi)外DNA損傷信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞周期 G2/M期阻滯的主要分子機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)Chk1/2-CDC25C通路和P53通路活性，進(jìn)而抑制CyclinB1/CDK1復(fù)合物的活性和進(jìn)入細(xì)胞核，最終引起G2/M期阻滯[10]。目前尚無(wú)DADS對(duì)卵巢上皮性癌細(xì)胞增殖和凋亡影響的相關(guān)報(bào)道，本研究初步探討了DADS對(duì)卵巢癌SK-OV- 3、OVCAR- 3細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制。

材料和方法

細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人上皮性卵巢癌細(xì)胞系SK-OV- 3、OVCAR- 3細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)。BALB/C nu/nu雌性裸鼠18只，購(gòu)自北京維通利華有限公司，鼠齡4～5周，體質(zhì)量10～15 g。

主要試劑和抗體RPMI 1640完全培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，MTT、DADS購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。將DADS與Tween 80以1∶2比例充分溶解，加入0.9%生理鹽水稀釋100倍，震蕩混勻，并以RPMI 1640完全培養(yǎng)基分別稀釋至終濃度為5、10、20、30 mg/L的工作液備用。順鉑(Cisplatin，DDP)為山東齊魯制藥廠產(chǎn)品，加入0.9%生理鹽水稀釋100倍，并以RPMI 1640完全培養(yǎng)基分別稀釋至終濃度為5、10、20、30 mg/L的工作液備用。鼠抗人檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白激酶1(checkpoint kinase 1，Chk1)單克隆抗體(單抗)、鼠抗人Chk2單抗、鼠抗人細(xì)胞分裂磷酸酶25C(cell division phosphostase 25C，CDC25C)單抗、山羊抗人p-CDC25C(ser216)多克隆抗體(多抗)、兔抗人p-CDK1(Thr14/Tyr15)多抗、鼠抗人細(xì)胞周期蛋白B1(CyclinB1)單抗、鼠抗人轉(zhuǎn)錄靶因子生長(zhǎng)阻滯及DNA損傷基因45α(growth arrest and DNA damage-indueible gene 45α，GADD45α)單抗、鼠抗人14- 3- 3σ單抗、山羊抗人Ki- 67多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，兔抗人細(xì)胞周期依賴激酶1(cyclin dependent kinase 1，CDK1)多抗、鼠抗人P53單抗、兔抗人p-P53(ser15)多抗、山羊抗人p-Chk1(ser345)多抗、兔抗人p-Chk2(Thr68)單抗、鼠抗人P21WAF1多抗、鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體、兔抗人Survivin單克隆抗體、鼠抗人Cleaved-caspase3單克隆抗體、膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、蛋白免疫印跡及免疫沉淀蛋白裂解液購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、兔抗人β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單抗、鼠抗兔單克隆IgG購(gòu)自北京中杉金橋科技有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)及分組SK-OV- 3、OVCAR- 3細(xì)胞接種于6孔板中，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)不同處理，分別將SK-OV- 3和OVCAR- 3細(xì)胞分為空白處理組、DADS處理組(實(shí)驗(yàn)組)和順鉑處理組(陽(yáng)性對(duì)照組)3組。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力分別將SK-OV- 3、OVCAR- 3細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入含DADS和順鉑(終濃度分別為5、10、20、30 mg/L)的培養(yǎng)基，每濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)5個(gè)空白處理細(xì)胞孔。分別繼續(xù)孵育12、24、48 h后更換成普通培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入5 mg/ml MTT液20 μl，4 h后棄去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，于搖床上低速振蕩10 min，置酶標(biāo)儀于492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%(各組細(xì)胞分別以空白處理組細(xì)胞為對(duì)照組，其余濃度組為實(shí)驗(yàn)組)，LOGIT法計(jì)算軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)，相同實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡用含DADS和順鉑(終濃度分別為5、10、20、30 mg/L)的培養(yǎng)基分別處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-OV- 3、OVCAR- 3細(xì)胞12、24、48 h，另設(shè)空白處理細(xì)胞組，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，1000 r/min(r=8 cm)離心5 min，各組分別收集1×105個(gè)細(xì)胞，棄上清液，加入195 μl Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC輕輕混勻后，再加入10 μl碘化丙啶混勻，室溫、避光孵育15 min，冰浴后立即置流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用Cell Quest軟件(美國(guó)BD公司)分析細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜋z測(cè)卵巢癌細(xì)胞移植瘤體積按照SPF標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)的18只裸鼠隨機(jī)分為空白處理組、DADS處理組、順鉑處理組3組，每組6只裸鼠，無(wú)菌操作將300 μl細(xì)胞懸液分別注射于各組裸鼠右前肢腋下皮膚下，SK-OV- 3、OVCAR- 3細(xì)胞各注射3只裸鼠，每只裸鼠注射107個(gè)細(xì)胞。自注射當(dāng)日起每日觀察裸鼠情況，注射第10日起分別給予腹腔注射生理鹽水、50 mg/kg DADS生理鹽水溶液、50 mg/kg順鉑生理鹽水溶液1次，以后每4 d注射1次，共注射5次。自注射當(dāng)日起第30日頸椎脫臼處死裸鼠，剝離腫瘤進(jìn)行測(cè)量。游標(biāo)卡尺分別測(cè)量皮下結(jié)節(jié)的最大長(zhǎng)徑及與其垂直的寬徑，腫瘤體積計(jì)算公式為：體積(mm3)=寬2×長(zhǎng)/2。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案符合中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制度倫理審查委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)方針，并經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布用普通培養(yǎng)基、含30 mg/L DADS的培養(yǎng)基、含30 mg/L順鉑的培養(yǎng)基分別處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-OV- 3、OVCAR- 3細(xì)胞24 h，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，分別收集3組細(xì)胞各1×106個(gè)，PBS漂洗細(xì)胞2次，70%冰乙醇固定24 h，洗滌離心后加入含100 mg/L核糖核酸酶A的碘化丙啶，室溫避光染色后采用FACScalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化，ModFit流式細(xì)胞周期分析軟件(美國(guó)Verity Software House公司)分析結(jié)果。

Westernblot檢測(cè)用普通培養(yǎng)基、含30 mg/L DADS的培養(yǎng)基分別處理SK-OV- 3、OVCAR- 3細(xì)胞24 h后更換成普通培養(yǎng)基，蛋白裂解液提取上述2組細(xì)胞總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)檢測(cè)蛋白濃度，控制樣品濃度在1～3 mg/ml。各組均取30 μg總蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰氨凝膠(PAGE)電泳，恒壓20 V，利用Trans-Blot半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，含5%脫脂奶粉、0.05%吐溫20枸

櫞酸鹽緩沖液(TBST)室溫封閉2 h，按每種目的蛋白一抗說(shuō)明書(shū)建議濃度4 ℃孵育過(guò)夜，相應(yīng)二抗IgG(1∶2000)室溫孵育2 h。ECL法檢測(cè)試劑盒顯色后曝光，Image Pro-Plus 6.0軟件(美國(guó)Media Cybernetics公司)分析各目的蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，分別計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié) 果

DADS對(duì)卵巢癌SK-OV-3和OVCAR-3細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測(cè)顯示，不同濃度的DADS作用SK-OV- 3(F=247.86，P=0.000)和OVCAR- 3細(xì)胞(F=302.54，P=0.000)后，隨著DADS濃度增高，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，呈濃度依賴性。DADS處理24 h時(shí)SK-OV- 3(F=335.12，P=0.000)和OVCAR- 3細(xì)胞(F=347.43，P=0.000)的增殖抑制率明顯高于處理12 h和48 h時(shí)的細(xì)胞抑制率，呈明顯的時(shí)間依賴性。順鉑對(duì)SK-OV- 3(F=289.35，P=0.000)和OVCAR- 3細(xì)胞(F=411.26，P=0.000)增殖的抑制呈濃度依賴性，但未觀察到明顯的時(shí)間依賴性(圖1、表1)。

DADS：二烯丙基二硫化物；DDP：順鉑；與同一組細(xì)胞其他處理濃度、其他處理時(shí)間相比，aP<0.05

DADS：diallyl disulfide；DDP：cisplatin；aP<0.05 compared with other dose or other time in the same cell group

A.SK-OV- 3；B.OVCAR- 3

圖1MTT檢測(cè)不同濃度的DADS和順鉑處理不同時(shí)間對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

Fig1Effects of different doses of DADS and DDP on the proliferation of ovarian cancer cells at different time points measured by MTT assay

表1 DADS和順鉑處理卵巢癌細(xì)胞不同時(shí)間的IC50值(n=5，-±s，mg/L)Table 1 The IC50 values of DADS and DDP in ovarian cancer cells at different time points(n=5，-±s，mg/L)

DADS：二烯丙基二硫化物；DDP：順鉑；與同一組細(xì)胞處理12、48 h相比，aP<0.05

DADS：diallyl disulfide；DDP：Cisplatin；aP<0.05 compared with 12，48 h in the same cell group

DADS對(duì)卵巢癌SK-OV-3和OVCAR-3細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的DADS作用SK-OV- 3、OVCAR- 3細(xì)胞后，隨著DADS濃度的增高，細(xì)胞凋亡率明顯升高，呈明顯的濃度依賴性(P<0.05)。DADS處理24 h時(shí)SK-OV- 3和OVCAR- 3細(xì)胞的凋亡率明顯高于處理12 和48 h時(shí)，呈明顯的時(shí)間依賴性(P<0.05)。順鉑對(duì)SK-OV- 3和OVCAR- 3細(xì)胞凋亡的影響呈濃度依賴性(P<0.05)，但未觀察到明顯的時(shí)間依賴性(表2、3)。

DADS對(duì)卵巢癌SK-OV-3和OVCAR-3細(xì)胞裸鼠移植瘤體積的影響所有裸鼠均形成皮下移植瘤，處死裸鼠后空白處理組、DADS處理組和順鉑處理組SK-OV- 3細(xì)胞移植瘤體積分別為(2050.95±215.75)、(575.17±85.94)和(206.83±16.29)mm3；空白處理組、DADS處理組和順鉑處理組OVCAR- 3細(xì)胞移植瘤體積分別為(799.74±70.71)、(534.11±24.89)和(246.57±56.78)mm3；與空白處理組相比，腹腔注射DADS溶液可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的裸鼠移植瘤體積(F=548.23，P=0.000；F=311.84，P=0.000)，但其抑瘤效果明顯弱于順鉑(F=291.46，P=0.001；F=175.12，P=0.007)(圖2)。

DADS對(duì)卵巢癌SK-OV-3和OVCAR-3細(xì)胞周期的影響分別將30 mg/L的DADS和順鉑作用于SK-OV- 3和OVCAR- 3細(xì)胞24 h后，與空白處理細(xì)胞相比，DADS處理后的SK-OV- 3和OVCAR- 3細(xì)胞中處于G2期的細(xì)胞百分率明顯增加(F=375.11，P=0.000；F=256.48，P=0.000)，而順鉑處理后則增加卵巢癌細(xì)胞S(F=315.43，P=0.000；F=208.49，P=0.000)和G2期細(xì)胞數(shù)目(F=387.16，P=0.000；F=223.53，P=0.000)(圖3、4)。

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度DADS作用于卵巢癌細(xì)胞后的凋亡率(n=3，-±s，%)Table 2 The apoptosis rates of ovarian cancer cells after treatment with different doses of DADS measured by flow cytometry(n=3，-±s，%)

與相同處理時(shí)間細(xì)胞其他處理濃度相比，aP<0.05；與同濃度細(xì)胞處理12、48 h相比，bP<0.05

aP<0.05 compared with other dose in the same time point group；bP<0.05 compared with 12 h and 48 h in the same dose group

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度順鉑作用于卵巢癌細(xì)胞后的凋亡率(n=3，-±s，%)Table 3 The apoptosis rates of ovarian cancer cells after treatment with different doses of DDP measured by flow cytometry(n=3，-±s，%)

與相同處理時(shí)間細(xì)胞其他處理濃度相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with other dose in the same time point group

圖2腹腔注射DADS和順鉑溶液對(duì)卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤體積的影響

Fig2Effects of DADS and DDP intraperitoneal injection on the xenograft tumor volumes of ovarian cancer cells

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) DADS和順鉑作用卵巢癌細(xì)胞24 h后的細(xì)胞周期分布情況

Fig3Effects on the cell cycle phase distribution of ovarian cancer cells treated with of DADS and DDP for 24 h(measured by flow cytometry assay)

與空白處理組細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)目相比，aP<0.05；與空白處理組細(xì)胞G2期細(xì)胞數(shù)目相比，bP<0.05

aP<0.05 compared with the S phase cell numbers of blank groups；bP<0.05 compared with the G2 phase cell numbers of blank groups

A.SK-OV- 3；B.OVCAR- 3

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DADS和DDP作用卵巢癌細(xì)胞24 h后的細(xì)胞周期分布情況

Fig4Effects on the cell cycle phase distribution of ovarian cancer cells treated with of DADS and DDP 24 h measured by flow cytometry

DADS對(duì)卵巢癌細(xì)胞中G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)、增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響將30 mg/L DADS分別作用于SK-OV- 3和OVCAR- 3細(xì)胞24 h后，p-Chk1(ser345)(F=108.89，P=0.013；F=97.58，P=0.018)、p-CDC25C(ser216)(F=87.25，P=0.025；F=114.25，P=0.009)、p-P53(ser15)(F=112.41，P=0.011；F=255.87，P=0.000)、P21WAF1(F=246.38，P=0.001；F=141.36，P=0.005)和p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白(F=298.12，P=0.000；F=233.15，P=0.000)的表達(dá)明顯增加，CDK1(F=308.24，P=0.000；F=257.55，P=0.000)和CyclinB1蛋白(F=223.15，P=0.001；F=241.28，P=0.000)的表達(dá)明顯減少，Chk1、Chk2、p-Chk2(Thr68)、CDC25C、P53、GADD45α、14- 3- 3σ蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化(P均>0.05)。此外，增殖和凋亡相關(guān)蛋白PCNA(F=77.36，P=0.031；F=157.28，P=0.001)、Ki- 67(F=205.64，P=0.007；F=315.22，P=0.000)和Survivin蛋白(F=122.13，P=0.013；F=188.24，P=0.000)表達(dá)明顯減少，Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯增加(F=86.46，P=0.023；F=99.11，P=0.009)(圖7、8)。

Mr:相對(duì)分子質(zhì)量

Mr:relative molecular mass

圖5Western blot檢測(cè)DADS對(duì)卵巢癌細(xì)胞G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig5Effects of DADS on the expressions of G2/M checkpoint related proteins of ovarian cancer cells measured by Western blot

與空白處理組細(xì)胞相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with blank cell group

A.SK-OV- 3；B.OVCAR- 3

圖6Western blot檢測(cè)DADS對(duì)卵巢癌細(xì)胞G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig6Effects of DADS on the expressions of G2/M checkpoint related proteins of ovarian cancer cells(measured by Western blot)

圖7Western blot檢測(cè)DADS對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig7Effects of DADS on the expressions of proliferation and apoptosis related proteins of ovarian cancer cells(measured by Western blot)

討 論

持續(xù)的生長(zhǎng)信號(hào)刺激、逃避生長(zhǎng)抑制和抵抗程序性死亡都是腫瘤細(xì)胞重要的生物學(xué)特性，細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系失調(diào)是造成腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[11- 12]。大蒜的主要有效成分為多種烯丙基硫化物，合稱為大蒜素，其主要成分為脂溶性的二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide，DATS)和DADS，大蒜素具有抗菌、抗血小板聚集、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗腫瘤等較多生物學(xué)作用[13- 14]。大蒜素的主要成分之一DADS可抑制多種致癌物質(zhì)導(dǎo)致的腫瘤性疾病的發(fā)生，還對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有直接抑制作用[15- 17]。研究表明，DADS可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因表達(dá)、調(diào)控凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)、影響端粒酶活性、誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯等多個(gè)環(huán)節(jié)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用[18- 20]。

與空白處理組細(xì)胞相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with blank group

圖8Western blot檢測(cè)DADS對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig8Effects of DADS on the expressions of proliferation and apoptosis related proteins of ovarian cancer cells(measured by Western blot)

G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)是細(xì)胞周期中除G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)之外最重要的細(xì)胞檢測(cè)點(diǎn)，CDK1蛋白是G2/M期傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的核心因子，CyclinB1/CDK1復(fù)合物是真核細(xì)胞有絲分裂G2/M期轉(zhuǎn)換所必需的蛋白激酶[21]。在細(xì)胞周期G2/M期，細(xì)胞內(nèi)外DNA損傷信號(hào)可通過(guò)調(diào)節(jié)CDC25C通路和P53通路活性，進(jìn)而抑制CyclinB1/CDK1復(fù)合物的活性和進(jìn)入細(xì)胞核，最終引起細(xì)胞周期 G2/M期阻滯[10]。在哺乳動(dòng)物中，DNA損傷信號(hào)主要由信號(hào)傳導(dǎo)蛋白共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因(ataxia telangiectasa mutated，ATM)和ATM及Rad3同源基因(ATM and Rad3 related，ATR)傳遞至效應(yīng)蛋白Chk1和Chk2，ATM/ATR可分別磷酸化Chk1的Ser345位點(diǎn)、Chk2的Thr68位點(diǎn)而激活Chk1、Chk2，進(jìn)而磷酸化CDC25C的Ser216位點(diǎn)，導(dǎo)致CDC25C失活而不能去磷酸化激活CDK1，最終引起細(xì)胞G2/M期阻滯[22]。此外，DNA損傷后還可以直接或間接通過(guò)ATM/ATR磷酸化P53的Ser15位點(diǎn)而激活P53，P53進(jìn)而通過(guò)其下游3個(gè)轉(zhuǎn)錄靶因子GADD45α、P21WAF1及14- 3- 3σ抑制CDK1活性，最終引起細(xì)胞G2/M期阻滯，其中P21WAF1是野生型p53基因最主要的調(diào)控靶因子[23]。CDK1蛋白的Thr14/Tyr15位點(diǎn)磷酸化和去磷酸化是調(diào)節(jié)CDK1活性的關(guān)鍵，CDK1的Thr14/Tyr15位點(diǎn)去磷酸化激活后進(jìn)而調(diào)節(jié)CyclinB1/CDK1復(fù)合物的活性，只有活化的CyclinB1/CDK1復(fù)合物才能觸發(fā)有絲分裂[24]。

近來(lái)有研究表明，DADS可引起胃癌BGC823細(xì)胞G2/M期阻滯，細(xì)胞中CyclinB1表達(dá)減少，P21、P53和GADD45α表達(dá)增加，沉默Chk1可部分消除DADS引起的CDC25C、CyclinB1表達(dá)減少和G2/M期阻滯[25]。另有研究顯示，DADS處理食管癌細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑、G2/M期阻滯，可能與CyclinB1、CDK1、p-CDK1、CDC25C表達(dá)減少有關(guān)，同時(shí)伴有p53、p21 mRNA表達(dá)增加和MEK1/2-ERK1/2通路活性降低[26]。

本研究觀察了DADS對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，DADS可以顯著抑制卵巢癌SK-OV- 3和OVCAR- 3細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，具有明顯的濃度和時(shí)間依賴性，并可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的體積。進(jìn)一步研究顯示，DADS可使SK-OV- 3和OVCAR- 3細(xì)胞G2期細(xì)胞百分率增加，p-Chk1(ser345)、p-CDC25C(ser216)、p-P53(ser15)、P21WAF1、p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表達(dá)增加，提示DADS可引起卵巢癌細(xì)胞CDK1活性降低、細(xì)胞G2/M期阻滯，可能與G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)Chk1-CDC25C和P53-P21WAF1通路激活有關(guān)。此外，在本研究中還觀察到CDK1、CyclinB1、PCNA、Ki- 67、Survivin蛋白表達(dá)明顯減少，Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯增加，提示DADS除了可以引起卵巢癌細(xì)胞CDK1活性降低之外，還可能直接抑制CDK1、CyclinB1蛋白表達(dá)，參與DADS誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞G2/M期阻滯，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖和凋亡能力發(fā)生變化。

綜上，本研究結(jié)果提示DADS處理卵巢癌細(xì)胞后可引起細(xì)胞增殖受抑和凋亡增加，并呈時(shí)間和濃度依賴性，初步分析其分子機(jī)制可能與DADS引起卵巢癌細(xì)胞G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)Chk1-CDC25C和P53-P21WAF1信號(hào)通路激活、CDK1活性降低、CDK1和CyclinB1蛋白表達(dá)減少，最終導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞G2/M期阻滯等多個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)。卵巢癌患者原發(fā)性或獲得性化療耐藥是臨床亟待解決的問(wèn)題，與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比，大蒜素具有無(wú)不良反應(yīng)、體內(nèi)無(wú)殘留等應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步研究大蒜素主要成分之一DADS的卵巢癌抗腫瘤效果，有望為卵巢癌患者的臨床治療提供新的藥物選擇，具有潛在的臨床價(jià)值和社會(huì)效益。