，，，， ,2

(1.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，湖南 常德415100; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128)

柑橘(Citrusreticulata)是我國(guó)南方地區(qū)重要的水果之一，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但柑橘鮮果不耐貯藏，容易發(fā)生霉變，極大地降低了其經(jīng)濟(jì)效益[1-2]。柑橘采后病害一般以真菌性病害為主，常見(jiàn)的真菌為指狀青霉(Peniciliumdigitatum)、意大利青霉(Peniciliumitalicum)、橙酸腐卵形孢菌(Oosporacitriaurantii)及鏈格孢屬(Alternaria)、疫霉屬(Phytophthora) 真菌[3-5]。相關(guān)研究表明，柑橘采后腐爛主要由綠霉病和青霉病引起，占總腐爛量的80%以上，病菌的侵害導(dǎo)致鮮果貯藏期、貨架期短，在造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)還對(duì)消費(fèi)者的健康造成一定的影響，因此，延長(zhǎng)柑橘鮮果的貯藏期非常必要[6-7]。目前市場(chǎng)上對(duì)柑橘貯藏的主要方式是化學(xué)試劑涂抹、熏蒸等，雖然具有一定延長(zhǎng)柑橘貯藏期的效果，但化學(xué)試劑具有一定毒性和殘留，因此，研制出一種無(wú)毒、無(wú)污染的綠色保鮮劑十分重要[8-10]。如今從植物中尋找天然抑菌活性物質(zhì)，是開(kāi)發(fā)和研制新型果蔬保鮮劑和殺菌劑的熱點(diǎn)之一，許多藥用植物提取物能有效抑制果蔬采后病害的發(fā)生和病原微生物的生長(zhǎng)繁殖，其主要?dú)⒕煞钟袚]發(fā)油類(lèi)、生物堿類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、醌類(lèi)、醚類(lèi)、黃酮類(lèi)、皂素類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)等[11-13]。為此，選擇高效低毒、低殘留、對(duì)環(huán)境影響小、不易產(chǎn)生抗藥性的植物源殺菌劑進(jìn)行抑菌效果研究，以期通過(guò)開(kāi)發(fā)植物源殺菌劑，有效地控制柑橘采后病害，減少化學(xué)殺菌劑的用量，提高柑橘果實(shí)貯藏期間的安全性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物共有72種，部分購(gòu)置于湖南九芝堂醫(yī)藥有限公司和湖南養(yǎng)天和大藥房，部分常見(jiàn)植物自行采摘。藥材經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物資源工程專(zhuān)業(yè)的肖深根教授鑒定。植物名稱(chēng)及藥用部位列于表1。供試菌種為意大利青霉、指狀青霉，由植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定。葡萄糖、瓊脂粉、丙酮等購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，均為分析純。主要儀器設(shè)備有HVA-85全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司)、DSZ2000X倒置生物顯微鏡(北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司)、TGCXZ-5B超聲循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥隆公司)、FA2004電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、Buchi R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)、DHG-9146A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(無(wú)錫建儀實(shí)驗(yàn)器材有限公司)、SR-A10N-50冷凍干燥機(jī)(上海舍巖儀器有限公司)、pH計(jì)(METTLER TOLEDO公司)、DH5000B 電熱恒溫培養(yǎng)箱(西安禾普生物科技有限公司)、FW100萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)、LX-600P冷卻水循環(huán)機(jī)(北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司)。

表1 供試植物名稱(chēng)及部位Tab.1 Test plant names and parts

續(xù)表1 供試植物名稱(chēng)及部位Tab.1 (Continued) Test plant names and parts

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備 自行采摘植物經(jīng)過(guò)50～60 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，連同所購(gòu)藥材分別打粉過(guò)0.15 ～0.30 mm篩，裝袋、編號(hào)。分別取各植物粉末10.0 g于100 mL潔凈的三角瓶中，加入50 mL丙酮提取溶劑，用保鮮膜封口，放入超聲儀中800 W、70 ℃提取1.5 h，抽濾，將濾液濃縮后倒入10 mL容量瓶中定容,得到質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的抑菌活性物質(zhì)，編號(hào)，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另?duì)迷迭香、肉桂、丁香提取物減壓濃縮后冷凍干燥至粉末，編號(hào)備用。

1.2.2 提取物抑菌效果測(cè)定 采用牛津杯法進(jìn)行抑菌測(cè)定[14]。將滅菌后的PDA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右，加入病原菌孢子懸浮液，使孢子最終濃度為105～106個(gè)/mL，將混有孢子的PDA培養(yǎng)基快速倒板。取牛津杯插入培養(yǎng)基中0.2 cm，等距放置4個(gè)，每個(gè)牛津杯中加入100 μL植物提取物(已過(guò)膜除菌)，培養(yǎng)皿封口后置于25 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。每種植物提取物設(shè)3個(gè)重復(fù)，另設(shè)丙酮作為空白試劑對(duì)照(CK1)，80 μg/mL納他霉素作為陽(yáng)性對(duì)照(CK2)。培養(yǎng)3 d后用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.3 提取物最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)測(cè)定 將各植物提取物分別與45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻，使提取物最終質(zhì)量濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。將混有提取物的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后加入濃度為105～106個(gè)/mL的病原菌孢子懸浮液0.5 mL，用小毛刷涂勻后封口，放置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以丙酮處理作為空白對(duì)照。每天觀察一次，觀察3 d，記錄生長(zhǎng)情況。

1.2.4 提取物最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)測(cè)定 根據(jù)最低抑菌質(zhì)量濃度，依次提高各提取物濃度倍數(shù)與PDA混合，倒入培養(yǎng)皿中，凝固后加菌，涂勻后封口，放置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以丙酮處理作為空白對(duì)照。每天觀察一次，觀察3 d，記錄生長(zhǎng)情況，確定無(wú)菌生長(zhǎng)的最低提取物質(zhì)量濃度。

1.2.5 提取物對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定 將迷迭香、肉桂、丁香提取物粉末分別與PDA培養(yǎng)基混合，制成最終質(zhì)量濃度為3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0(對(duì)照)mg/mL的平板，待其凝固后將直徑0.9 cm的供試病菌菌餅放置在平板的中央，每皿放置1塊，重復(fù)3次，將培養(yǎng)皿封口后放置25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 d。菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)距離-處理菌落凈生長(zhǎng)距離)/對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)距離×100%。

1.2.6 提取物對(duì)病原菌孢子形成的影響 在6孔板中加入800 μL土豆液體培養(yǎng)基和200 μL孢子懸浮液，使孢子最終濃度為105個(gè)/mL，培養(yǎng)10 h，待孢子全部萌發(fā)后，將迷迭香、肉桂、丁香提取物粉末分別加入6孔板中，使得提取物最終質(zhì)量濃度為3.0、2.0、1.0、0.5、0 mg/mL，將6孔板放入25 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3 d，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.7 提取物對(duì)柑橘果實(shí)發(fā)病率的影響 取無(wú)損傷的寬皮柑橘果實(shí)100個(gè)，均勻噴灑2種霉菌孢子混合溶液(105～106個(gè)/mL)，在常溫下貯藏3 d。再用2.0 mg/mL的3種提取液分別均勻噴灑果皮表面，放在陰涼通風(fēng)處晾干，然后將果實(shí)放置于18 ℃、RH 90%的冷庫(kù)中貯藏，對(duì)照噴灑無(wú)菌水。每種提取物重復(fù)3次試驗(yàn)。每隔10 d測(cè)定一次果實(shí)的發(fā)病率。發(fā)病率=發(fā)病果實(shí)個(gè)數(shù)/果實(shí)總數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用WPS 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖形制作。采用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物提取物的抑菌活性

2.1.1 植物提取物對(duì)菌體的抑制效果 不同植物提取物抑菌效果具有較大的差別，如表2所示，有20種植物具有較強(qiáng)的抑菌活性，其中丁香、肉桂、迷迭香、細(xì)辛、山蒼子、零陵香、鳳仙透骨草、廣藿香、博落回等抑菌效果突出，抑菌圈直徑達(dá)到了20～35 mm。從結(jié)果可以看出，一般含有較多揮發(fā)油的植物具有較強(qiáng)的抑制真菌能力，同時(shí)鳳仙透骨草、博落回等含有生物堿、醌類(lèi)、黃酮類(lèi)的植物也具有一定的抑菌作用。

表2 植物提取物對(duì)病原菌菌體的抑制效果Tab.2 Inhibition effect of plant extracts on pathogenic fungi mm

2.1.2 植物提取物對(duì)菌體的MIC、MBC值 如表3所示，丁香、肉桂、迷迭香對(duì)2種致病菌的抑制效果較好，其MIC值非常低，僅為3.125～6.25 mg/mL，另外抑菌效果較好的還有細(xì)辛、山蒼子、零陵香、鳳仙透骨草、廣藿香、博落回、孜然、青蒿等，MIC值在6.25～25 mg/mL。各植物提取物的MBC值明顯增大，其中抑菌效果相對(duì)較好的是丁香，MBC值為25 mg/mL，可能是粗提物有效抑菌物質(zhì)含量低或純度低，以致殺菌的濃度偏高，這與康帥等[15]研究結(jié)果相似。

表3 植物提取物對(duì)病原菌MIC、MBC的測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of MIC and MBC to pathogens by plant extracts mg/mL

2.2 不同濃度植物提取物對(duì)病原菌的抑制效果

2.2.1 不同濃度提取物對(duì)病原菌孢子形成的影響 不同提取物對(duì)病原菌孢子形成的影響具有一定的差異。如表4所示，采用0.5 mg/mL質(zhì)量濃度處理時(shí)，意大利青霉孢子數(shù)在(3.22～4.20)×107個(gè)，指狀青霉孢子數(shù)在(2.85～3.50)×107個(gè)，其中丁香處理組抑制效果略好于其余2組。隨著各處理組質(zhì)量濃度的增加，對(duì)孢子形成的影響也逐漸加大，當(dāng)采用3.0 mg/mL質(zhì)量濃度處理時(shí)，孢子數(shù)量明顯減少，指狀青霉孢子數(shù)在(0.02～0.22)×107個(gè)，較對(duì)照降低了95.64%～99.60%，意大利青霉孢子數(shù)在(0.20～0.65)×107個(gè)，較對(duì)照降低了86.84%～95.95%。其中，丁香處理組孢子數(shù)最少，指狀青霉孢子數(shù)僅為0.02×107個(gè)。

表4 不同濃度植物提取物對(duì)病原菌孢子形成的影響Tab.4 Effects of different concentrations of plant extracts on sporulation of pathogenic fungi ×107個(gè)

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note： Different lower-case letters in the same column indicated that there was significant difference (P<0.05), the same below.

2.2.2 不同濃度提取物對(duì)意大利青霉的抑制率 不同濃度提取物對(duì)意大利青霉的抑制效果具有一定的差異。如圖1所示，采用0.5 mg/mL質(zhì)量濃度處理時(shí)，抑制率在6.83%～11.01%，隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，抑制效果逐漸提高，提取物質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時(shí)抑菌效果增加較為明顯，抑制率達(dá)到了50%左右，當(dāng)采用質(zhì)量濃度2.5 mg/mL處理時(shí)，迷迭香、丁香、肉桂組抑制率分別達(dá)到了64.19%、84.64%、72.25%。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度增加到3.0 mg/mL時(shí)，3個(gè)處理組的抑制率均達(dá)到了85%以上，說(shuō)明3種提取物均具有較好的抑菌效果。通過(guò)回歸分析，迷迭香、丁香、肉桂3種提取物的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(EC50)分別為2.43、2.04、2.14 mg/mL。

圖1 不同濃度植物提取物對(duì)意大利青霉的抑制率Fig.1 The inhibition rate of different concentrations of plant extracts on P.italicum

2.2.3 不同濃度提取物對(duì)指狀青霉的抑制率 如圖2所示，在提取物質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，3種植物提取物對(duì)指狀青霉的抑制率為12.95%～14.59%，隨著提取物質(zhì)量濃度增加，抑制效果逐漸增強(qiáng)，采用2.0 mg/mL質(zhì)量濃度處理時(shí)，抑菌效果有了明顯的提高，抑制率達(dá)到了60%以上，當(dāng)采用質(zhì)量濃度2.5 mg/mL處理時(shí)，迷迭香、丁香、肉桂組抑制率分別達(dá)到了75.06%、78.02%、79.77%。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度增加到3.0 mg/mL時(shí)，3個(gè)處理組的抑制率均達(dá)到了90%以上，說(shuō)明此時(shí)指狀青霉幾乎完全得到了抑制。通過(guò)回歸分析，迷迭香、丁香、肉桂三者的提取物對(duì)指狀青霉的EC50值分別為1.79、1.68、1.74 mg/mL。

圖2 不同濃度植物提取物對(duì)指狀青霉的抑制率Fig.2 The inhibition rate of different concentrations of plant extracts on P.digitatum

2.3 不同植物提取物對(duì)柑橘果實(shí)發(fā)病率的影響

采用不同植物提取物處理柑橘果實(shí)，每10 d測(cè)定一次果實(shí)發(fā)病率，結(jié)果如表5所示。果實(shí)貯藏30 d 時(shí)對(duì)照組果實(shí)的發(fā)病率達(dá)到了23%，3個(gè)處理組的果實(shí)發(fā)病率明顯較低，僅為對(duì)照組的21.74%～39.13%。對(duì)照組果實(shí)在貯藏50 d時(shí)發(fā)病率高達(dá)66%，而處理組果實(shí)發(fā)病率保持在30%左右，說(shuō)明提取物對(duì)柑橘果實(shí)具有較好的防腐保鮮作用。在柑橘果實(shí)貯藏60 d時(shí)，對(duì)照組幾乎已全部發(fā)病，發(fā)病率達(dá)到了89%，而丁香處理組果實(shí)發(fā)病率為46%，肉桂、迷迭香處理組分別為52%、57%，相比對(duì)照組果實(shí)發(fā)病率分別減少了48.31%、41.57%、35.96%。3個(gè)處理組間，丁香處理組效果略好于肉桂組，肉桂處理組略好于迷迭香處理組。

表5 不同植物提取物對(duì)柑橘果實(shí)發(fā)病率的影響Tab.5 Effects of different plant extracts on the disease incidence of inoculated citrus fruits %

3 結(jié)論與討論

丁香、肉桂、迷迭香、細(xì)辛、山蒼子、零陵香、鳳仙透骨草、廣藿香、博落回等植物提取物對(duì)柑橘采后主要病害病原菌具有較強(qiáng)的抑菌效果。當(dāng)提取物的質(zhì)量濃度增加到3.0 mg/mL時(shí)，丁香、肉桂、迷迭香對(duì)意大利青霉、指狀青霉的抑制率均達(dá)到了85%以上，青霉菌得到了有效抑制。柑橘果實(shí)分別經(jīng)丁香、肉桂、迷迭香這3種中藥提取物處理后60 d，相對(duì)于對(duì)照組，果實(shí)發(fā)病率減少了35.96%～48.31%，但是果實(shí)感染真菌后儲(chǔ)藏期最好控制在30 d以?xún)?nèi)。植物提取物可經(jīng)過(guò)進(jìn)一步完善配方后用于柑橘大規(guī)模綠色防腐處理，以延長(zhǎng)柑橘的貨架期，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

丁香等部分植物源殺菌劑對(duì)柑橘采后病害具有一定的抑菌效果，采用質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的生藥處理，抑菌圈直徑可達(dá)20～35 mm，這些具有較強(qiáng)抑菌作用的中藥材提取物中一般含有較多的揮發(fā)油物質(zhì)及生物堿、黃酮和醌類(lèi)物質(zhì)，這些植物代謝物可在一定程度上殺滅柑橘采后病原真菌，這與戴素明等[16]、付雯等[17]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，還有個(gè)別具有揮發(fā)油、黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取物抑菌效果不是非常好，這可能是因?yàn)樘崛》椒ú痪哂嗅槍?duì)性，有效成分的提取率不高，或者提取物本身抑菌效果不佳[18]。在后期試驗(yàn)中，可單獨(dú)對(duì)幾種或某種抑菌效果好的藥材提取物進(jìn)行分離純化，從而判定出具體的主要抑菌物質(zhì)及其抑菌能力。對(duì)部分效果較強(qiáng)的中藥材進(jìn)行最低抑菌質(zhì)量濃度和最低殺菌質(zhì)量濃度的測(cè)定，結(jié)果表明，丁香、肉桂、迷迭香的MIC值較低，僅在3.125～6.25 mg/mL，一方面說(shuō)明提取物抑菌效果較好，另一方面說(shuō)明這些抑菌較強(qiáng)的植物在柑橘防腐保鮮方面具有較高的利用價(jià)值。提取物的MBC值較大，通常遠(yuǎn)大于MIC值，抑菌效果較好的丁香其MBC值達(dá)25 mg/mL，有些具有一定抑菌效果的植物MBC值達(dá)到了400 mg/mL，這可能是提取物雜質(zhì)過(guò)多，有些糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)反而有利于病原菌生長(zhǎng)，因此不利于提取物殺菌[19]。

當(dāng)丁香、肉桂、迷迭香提取物以3.0 mg/mL質(zhì)量濃度處理病原菌時(shí)，菌絲所產(chǎn)生孢子的數(shù)量明顯減少，指狀青霉、意大利青霉孢子數(shù)分別減少了95.64%～99.60%、86.84%～95.95%，說(shuō)明提取物不利于菌絲孢子的形成，阻礙了菌絲的正常生理代謝。通過(guò)回歸分析發(fā)現(xiàn)，迷迭香、丁香、肉桂提取物對(duì)意大利青霉菌絲生長(zhǎng)的EC50值分別為2.43、2.04、2.14 mg/mL，對(duì)指狀青霉的EC50值分別為1.79、1.68、1.74 mg/mL，平均EC50值為2.11、1.86、1.94 mg/mL。3種植物提取物的EC50值均較低，抑菌效果較好，這可能是因?yàn)檫@些植物代謝物可改變細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞代謝和分化，擾亂細(xì)胞的正常生理功能，從而抑制或殺滅真菌[20-23]。3種提取物對(duì)柑橘果實(shí)的處理中，在果實(shí)貯藏60 d后，對(duì)照組柑橘幾乎全部腐爛，處理組果實(shí)發(fā)病率降低了35.96%～48.31%。植物提取物處理組可明顯減少果實(shí)發(fā)病率，一方面是因?yàn)樘崛∥餁缌苏婢硪环矫婵赡苁翘崛∥飳?duì)果實(shí)本身具有一定的防腐保鮮作用[24-25]。