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(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的一類重要的植物病害，可導(dǎo)致番茄果實(shí)腐爛和減產(chǎn)[1-2]。生物防治及抗生素防治是遏制番茄灰霉病的有效手段。作為有效防治番茄灰霉病的生防菌劑，多株商業(yè)化的芽孢桿菌已被登記注冊并投入市場[3]。木霉菌[4]和唐菖蒲伯克霍爾德菌[5]是防治番茄灰霉病的有效菌株。此外，放線菌也是一類有效抑制番茄灰霉病的生防菌來源。徐大勇等[6]從土壤中分離到1株吸水鏈霉菌HNU-1，其發(fā)酵濾液6.67倍稀釋液對番茄灰霉病的預(yù)防和治療效果分別為87.8%和77.9%。王美琴等[7]從番茄植株根莖接合部分離到1株酒紅鏈霉菌菌株St24，其對番茄灰霉病菌具有顯著的抑菌活性。

因?yàn)榉啪€菌可以合成豐富多樣的抑菌活性產(chǎn)物，所以抑菌活性放線菌的分離也是生防研究的焦點(diǎn)[8]。沈玲[9]從土壤、水和煤樣品中分離出409株放線菌，其中有2株抑菌活性較強(qiáng)的鏈霉菌；宋洪允等[10]分析了從土壤中分離的94株放線菌，獲得了4株具有較高抑菌活性的放線菌；朱正兵等[11]從土壤中篩選出4株對油菜菌核病菌有顯著抑制活性的放線菌；張志斌等[12]從野生稻根中分離的鏈霉菌FRo2對小麥赤霉菌、立枯絲核菌等均有較好的抑菌效果；BOUKAEW等[13]為防治辣椒根腐、莖腐和青枯病，從265株候選鏈霉菌菌株中篩選出14株有抑菌活性的菌株。但是針對番茄灰霉病分離的放線菌較少，且主要研究內(nèi)容集中于生防活性測定。生防菌在田間應(yīng)用往往存在效果不理想、活性穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。為此，從遼寧省各地不同生境采集的土樣中分離篩選新型放線菌，通過分析菌株合成產(chǎn)物的穩(wěn)定性及化學(xué)成分，發(fā)掘新型拮抗灰葡萄孢菌的天然產(chǎn)物，為進(jìn)一步開發(fā)新穎、高生防活性的生物源農(nóng)藥提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試放線菌菌株 分離自遼寧省各地所采集的110份土壤樣品，共44株。

1.1.2 供試病原菌 灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea，分離自番茄灰霉病樣品)、禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus，分離自小麥根腐病樣品)、辣椒疫霉菌(PhytophthoracapsiciLeonian，分離自辣椒疫病樣品)、串珠鐮孢菌(FusariummoniliformeSheld.，分離自水稻惡苗病樣品)、大斑凸臍蠕孢(Exserohiumturcicum，分離自玉米大斑病樣品)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum，分離自小麥赤霉病樣品)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum，分離自向日葵菌核病樣品)由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理教研室分離并提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①保存及繁殖培養(yǎng)基:高氏一號培養(yǎng)基，含可溶性淀粉20 g/L、KNO31 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、瓊脂粉18 g/L。②產(chǎn)孢培養(yǎng)基：綠豆湯培養(yǎng)基，質(zhì)量濃度30 g/L(煮沸去渣)。③生測及病原菌保藏培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，含葡萄糖20 g/L、馬鈴薯200 g/L、瓊脂粉18 g/L。④孢子萌發(fā)培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基(沈陽和君生物科技有限公司)。

1.1.4 供試藥劑 百菌清藥劑(99.97%，百靈威科技有限公司)原藥以少量DMSO加水配制成250 μg/mL母液。

1.2 活性放線菌的篩選和抑菌活性測定

1.2.1 放線菌抑菌活性初篩 采用平板對峙法。用5 mm打孔器打取病原真菌菌餅，接于PDA平板中央，在四周分別等距離接入5 mm的放線菌菌餅，對照(CK)用5 mm的瓊脂塊代替，每個處理重復(fù)3次。于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待CK中真菌長滿平板時，觀察有無抑菌環(huán)出現(xiàn)，若有則記錄抑菌環(huán)直徑。

1.2.2 放線菌抑菌活性復(fù)篩 復(fù)篩采用菌絲生長速率法。取初篩后抑菌活性較好的放線菌，用接種環(huán)挑取少量菌絲接種于裝有10 mL高氏一號培養(yǎng)液的試管中，在150 r/min搖床上培養(yǎng)3～5 d，將發(fā)酵液經(jīng)濾膜過濾后與熔化的PDA培養(yǎng)基按照1∶9的比例混合，制成發(fā)酵液培養(yǎng)基，對照(CK)用PDA培養(yǎng)基代替。用5 mm的打孔器打取供試病原真菌的菌餅，接種于發(fā)酵液培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待CK中真菌長滿平板時，記錄發(fā)酵液平板中真菌的直徑大小，并計算抑制率。每個處理重復(fù)3次。抑制率=[(對照菌落直徑-菌餅直徑)-(處理菌落直徑-菌餅直徑)]/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.2.3 放線菌發(fā)酵液的制備 取保存于試管中的放線菌，挑取菌絲劃線于高氏一號平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，用直徑8 mm打孔器打取菌餅，接種8塊于裝有100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，在無菌條件下以無菌注射器吸取發(fā)酵液利用細(xì)菌濾器過濾掉菌絲體備用。

1.2.4 孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn) 取培養(yǎng)好的灰葡萄孢菌(紫外處理產(chǎn)孢[14])、禾旋孢腔菌(大于72 h高氏一號平板培養(yǎng)產(chǎn)孢)、禾谷鐮孢菌(綠豆湯培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)孢[15])、大斑凸臍蠕孢(大于72 h高氏一號平板培養(yǎng)產(chǎn)孢)的孢子，配成適當(dāng)濃度的懸浮液(10×10低倍鏡下，每視野30～40個孢子為宜)，以發(fā)酵液∶孢子懸浮液∶孢子萌發(fā)培養(yǎng)基RPMI1640=1∶1∶2的體積比混合，每孔200 μL分裝入96孔板，以百菌清(50 μg/mL)+高氏一號和ddH2O分別替代發(fā)酵液加入培養(yǎng)體系作為對照，每個試驗(yàn)重復(fù)3次，分別于0、48、72 h以酶標(biāo)儀(Multiskan GO，美國Thermo)測定每個處理OD600。計算孢子萌發(fā)抑制率，抑制率=(對照吸光度差-處理吸光度差)/對照吸光度差×100%[16]。

1.3 活性放線菌的分子生物學(xué)鑒定

采用高鹽法提取放線菌總DNA，以細(xì)菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 采用PCR擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因。反應(yīng)體系為20 μL:10 μLTaqBuffer Mix，正、反向引物各1 μL，1 μL DNA模板，7 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共31個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物送交華大北京測序技術(shù)服務(wù)公司完成測序，利用Ezbiocloud在線比對軟件(https://www.ezbiocloud.net/)進(jìn)行序列相似性搜索，利用Clustal X進(jìn)行序列同源性比對，再用MEGA 5.0軟件以最大似然法(Maximum likehood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，初步確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.4 活性放線菌代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性測定

將以下方法制備的無菌發(fā)酵液按照1.2.2中描述方法進(jìn)行試驗(yàn)，并計算抑制率。

1.4.1 溫度穩(wěn)定性 取發(fā)酵液3 mL放入5 mL的EP管內(nèi)，分別在-20、4、30、50、70、100、120 ℃下處理30 min, 每個溫度重復(fù)3次。

1.4.2 酸堿穩(wěn)定性 將發(fā)酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調(diào)整pH值至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14, 靜置12 h, 再分別將各發(fā)酵液的pH值慢慢調(diào)至原發(fā)酵液初始值(7.5), 每個pH值重復(fù)3次。

1.4.3 蛋白酶穩(wěn)定性 取發(fā)酵液6 mL 放入10 mL的EP管內(nèi)，分別加入終質(zhì)量濃度為1.5 g/L的蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶，在37 ℃下處理60 min, 陽性對照(CK)不添加酶，均重復(fù)3次。

1.5 活性放線菌抑菌產(chǎn)物的初步分離與鑒定

挑取純化的活性菌株單菌落接種至5 mL高氏一號液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖菌培養(yǎng)48 h，之后以5%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL高氏一號培養(yǎng)基3瓶，以220 r/min繼續(xù)搖菌72 h。其中2瓶發(fā)酵完畢收集菌液并離心，產(chǎn)物為菌餅及發(fā)酵上清液，以甲醇和丙酮-水(7∶3)浸泡菌餅過夜，隨后分離的甲醇浸泡液和丙酮-水浸泡液分別與相應(yīng)發(fā)酵上清液混合。另一瓶調(diào)節(jié)pH值至10，以200 mL乙酸乙酯抽提2遍。分別減壓蒸餾以清除甲醇、丙酮、乙酸乙酯和水，得到的提取產(chǎn)物以1 mL甲醇溶解，過0.22 μm濾膜后，以安捷倫1290 Infinity Ⅱ+6460 Triple Quad LC/MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性放線菌的篩選

采用平板對峙法對44株土壤放線菌進(jìn)行抑菌活性初篩，獲得13株有抑菌活性的放線菌，占所分離放線菌總數(shù)的29.5%。其中，SA32、SA33、SA35、SA37、SA38、SA39、SA47、SA49、SA51這9株放線菌對多種病原真菌均有抑制作用，而SA36、SA42、SA45、SA46只對1種真菌有抑制作用，但抑制率明顯較前9種高(數(shù)據(jù)未展示)。挑選抑菌活性較高的SA32、SA33、SA37、SA39、SA45、SA51等6株放線菌和5株被抑制的病原真菌做進(jìn)一步的無菌發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)。

從表1可以看出，除SA45和SA51外其他4株放線菌均對灰葡萄孢菌、禾旋孢腔菌、禾谷鐮孢菌、核盤菌和大斑凸臍蠕孢有非常好的抑制作用。其中SA37的抑菌作用最好，對5種病原菌的抑制率均在70%以上，其對灰葡萄孢菌的抑制率為75.13%。SA45雖只有單一活性，但是對灰葡萄孢菌的抑制率高達(dá)79.27%。

表1 放線菌無菌發(fā)酵液對病原真菌的抑制率

2.2 活性放線菌對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用

采用96孔板法測定SA32、SA33、SA37、SA39、SA45、SA51等6株放線菌發(fā)酵液對灰葡萄孢菌、禾旋孢腔菌、禾谷鐮孢菌和大斑凸臍蠕孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用。因核盤菌的萌發(fā)和繁殖方式以菌核為主，孢子生長存在芽管限制等問題[17]，因此未研究對其孢子萌發(fā)的抑制作用。

從表2可以看出，所測試的6株放線菌對灰葡萄孢菌的孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用。其中，SA33、SA37、SA39、SA45菌株的發(fā)酵液對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制率高于百菌清。SA37在72 h對灰葡萄孢菌、禾旋孢腔菌和禾谷鐮孢菌的孢子萌發(fā)均有一定的抑制效果，其中對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制率為86.25%。而SA45在48 h和72 h對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制率高達(dá)70.03%和93.43%。

表2 6株放線菌對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制率

2.3 活性放線菌的分子生物學(xué)鑒定

測定6株生防放線菌的16S rRNA基因序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。SA32、SA33、SA37、SA39、SA51 五株菌在進(jìn)化關(guān)系上較為接近，均聚類于鏈霉菌屬(Streptomyces)。SA32、SA33與婁徹鏈霉菌(Streptomycesrochei)的16S rRNA基因序列同源性最高，分別為99.2%和98.81%，SA37和SA39與淡紫褐鏈霉菌(Streptomycesenissocaesilis)的16S rRNA基因序列同源性最高，均為100%，SA51與親和素鏈霉菌(Streptomycesavidinii)的16S rRNA基因序列同源性最高，為99.93%。而SA45較為特別，聚類于北里孢菌屬(Kitasatospora)，其16S rRNA基因序列與Kitasatosporaphosalacinea同源性最高，為99.35%，屬于稀有放線菌類群。將16S rRNA基因序列提交至GenBank，注冊號分別為SA32 MH725558、SA33 MG847143、SA37 MG847153、SA39 MG847154、SA45 MG847155、SA51 MG847156。

2.4 活性放線菌代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性

2.4.1 溫度穩(wěn)定性 由圖2可知，在4 ℃、30 ℃及50 ℃，SA37、SA45發(fā)酵液的抑菌活性最高。隨著處理溫度的進(jìn)一步升高，發(fā)酵液的抑菌活性下降。當(dāng)溫度達(dá)到70～120 ℃時，2株放線菌發(fā)酵液的抑菌活性嚴(yán)重喪失。在-20 ℃的低溫中，菌株發(fā)酵液的抑菌活性稍有降低。結(jié)果表明，SA37、SA45發(fā)酵液抑菌活性在中低溫具有良好的穩(wěn)定性。

泊松校驗(yàn)1 200次，>70%的值在分支節(jié)點(diǎn)處標(biāo)出

圖2 溫度對無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the antimicrobial activity of axenic fermentation broth

2.4.2 酸堿穩(wěn)定性 由圖3可知，菌株SA37、SA45發(fā)酵液在pH值7～9的中性環(huán)境中抑菌活性保持正常，在酸性環(huán)境和堿性環(huán)境下均不穩(wěn)定，但SA45抑菌活性始終高于SA37，且相對于SA37在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下低于10%的抑制活性，SA45在pH值為1和14時的活性能保持在20%～30%，說明SA45在酸堿條件下的穩(wěn)定性相對較高。為了分離有效化合物，在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)保持中性pH值范圍。

2.4.3 蛋白酶穩(wěn)定性 由圖4可知，采用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后，菌株SA37抑菌活性下降了21.7%～30.9%，說明發(fā)酵液中可能存在部分蛋白質(zhì)類抑菌物質(zhì)，而SA45發(fā)酵液抑菌活性并無明顯變化，說明不存在蛋白質(zhì)或者肽類抑菌物質(zhì)。

圖3 pH值對無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of pH on the antimicrobial activity of axenic fermentation broth

圖4 蛋白酶對無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of proteases on the antimicrobial activity of axenic fermentation broth

2.5 活性放線菌抑菌產(chǎn)物的初步鑒定

因?yàn)镾A45為稀有放線菌北里孢菌，合成新穎抑菌化合物的概率較高，所以檢測了SA45菌株的天然發(fā)酵產(chǎn)物，以期發(fā)現(xiàn)新型化合物。利用丙酮[18-19]、甲醇及乙酸乙酯[20]作為有機(jī)溶劑分別抽提SA45發(fā)酵液，濃縮后以高分辨率飛行質(zhì)譜檢測，結(jié)果如圖5所示。與已知的北里孢菌相比較，發(fā)酵液中無相同抑菌活性物質(zhì)的質(zhì)譜信息，說明北里孢菌SA45沒有合成已知的灰葡萄孢菌抑菌產(chǎn)物。

A.甲醇浸提化合物；B.丙酮-水浸提化合物；C.乙酸乙酯浸提化合物

3 結(jié)論與討論

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌引起的一類重要的農(nóng)業(yè)植物病害，而放線菌是一類有效的農(nóng)用抗生素來源菌株，篩選新型有效的抗番茄灰霉病菌放線菌及其天然產(chǎn)物是一項(xiàng)具有前景和實(shí)際意義的工作。本研究針對多種植物病原菌篩選到6株灰葡萄孢菌拮抗放線菌，這6株菌對禾旋孢腔菌、禾谷鐮孢菌和大斑凸臍蠕孢菌等也有良好的抑制效果。菌株SA37和SA45發(fā)酵液在-20～120 ℃、pH值1～14和3種酶(蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶)處理?xiàng)l件下的抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，過高或過低的溫度和pH值均會對放線菌發(fā)酵液的抑菌活性造成不可逆的影響，該結(jié)果類似于張孟等[21]對海洋放線菌的研究。

北里孢菌(Kitasatosporasp.)是一類稀有放線菌，是由OMURA等[22]在1982年建立的屬。自發(fā)現(xiàn)并建立北里孢菌屬以來，研究者從該屬菌株中分離到了種類豐富的天然產(chǎn)物。該類菌最初多被作為生防活性菌株進(jìn)行分離，分離的菌株及其合成的次生代謝產(chǎn)物均具有優(yōu)良的生防活性[18,23]。王云等[24]從腐木及枯枝落葉樣品中分離到1株對林業(yè)害蟲松材線蟲殺滅活性較高的北里孢菌C620，并初步鑒定其活性化合物為1-苯基-3-(2-吡啶)-5-吡唑啉酮。MOMOSE等[25]分離得到的蛋白酶抑制劑Tyropeptin甚至具有抗腫瘤活性。從北里孢菌分離的天然產(chǎn)物還包括Kitasatatin 1[26]等縮環(huán)肽類和Fuzanins[27]等吡啶類化合物。其中抗真菌活性天然產(chǎn)物以大環(huán)內(nèi)酯類化合物Setamycin[28]與Bafilomycin[29]為主，2種化合物的結(jié)構(gòu)相同或相似于WERNER等[20]在Streptomycesgriseussp.SulphurusTü 1922中發(fā)現(xiàn)的Bafilomycin系列化合物。另外，北里孢菌屬菌株還合成了Cystargin[18]和Kimorexins[19]2類高分子化合物。SA45發(fā)酵液粗提物高分辨率質(zhì)譜分析結(jié)果表明，粗提物中并不存在已報道的這幾種化合物，意味著SA45中可能存在新型結(jié)構(gòu)的抗真菌次生代謝產(chǎn)物，值得進(jìn)一步研究。SA45產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有良好的抑菌活性，較為穩(wěn)定，而且不同于已報道的抑菌化合物，具有潛在的應(yīng)用和研究價值。

本研究從分離的44株放線菌庫中篩選出6株對灰葡萄孢菌具有抑菌效果的放線菌，除SA45和SA51外，其余4株放線菌對多種農(nóng)業(yè)病原菌具有廣泛的抑菌譜。番茄灰霉病、小麥根腐病、小麥赤霉病和玉米大斑病均為農(nóng)業(yè)上重要的病害[30-33]，平板試驗(yàn)和孢子抑制試驗(yàn)均表明，鏈霉菌SA32發(fā)酵液對灰葡萄孢菌、禾旋孢腔菌、禾谷鐮孢菌和大斑凸臍蠕孢菌的菌落、孢子和菌絲生長有優(yōu)良的抑制效果，72 h時SA32發(fā)酵液對禾旋孢腔菌孢子萌發(fā)的抑制活性高達(dá)93.13%，其優(yōu)良廣譜的生防活性使SA32的發(fā)酵液成為潛在的天然產(chǎn)物來源。72 h時SA33、SA37和SA39發(fā)酵液對灰葡萄孢菌的抑菌活性雖然低于北里孢菌SA45，但是高于百菌清對照，其代謝產(chǎn)物成分值得進(jìn)一步研究。

致謝：感謝沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理教研室提供的植物病原菌，感謝沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用生物科學(xué)教研室提供試驗(yàn)及相關(guān)儀器設(shè)備支持。