，，，，， ，

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001; 2.河南省中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000)

煙草加工過程中根據(jù)不同卷煙配方要求將不同品種葉絲進(jìn)行參配，經(jīng)后續(xù)加工處理，最終加工成不同風(fēng)格和品質(zhì)的卷煙[1-4]。在卷煙生產(chǎn)加工過程中，由于不同品種煙葉在收購價格上存在差異，魚目混珠現(xiàn)象時有發(fā)生，最終造成卷煙配方失真、卷煙品質(zhì)出現(xiàn)波動。煙草品種鑒定常通過分級人員眼觀手摸從形態(tài)上對煙草品種進(jìn)行判斷，該鑒定方法雖簡單經(jīng)濟，但準(zhǔn)確性有待商榷[5]。近年來，隨著分子生物學(xué)發(fā)展，品種鑒定方法由宏觀向微觀進(jìn)行變化，多種分子標(biāo)記方法已用于煙草品種的鑒定研究。其中，RAPD標(biāo)記技術(shù)于1990年首次提出，因具有操作簡單、費用低、速度快、靈敏度高等優(yōu)點[6]，在煙草的品種鑒定、親緣關(guān)系分析、抗性鑒定等方面廣泛應(yīng)用[7-11]。王志德等[7]利用43個RAPD隨機引物對24個煙草核心種質(zhì)進(jìn)行分析，建立了相關(guān)的指紋圖譜，并利用聚類分析方法成功對其進(jìn)行遺傳關(guān)系分析。楊友才等[8]利用RAPD方法篩選出28個隨機引物，對48個煙草品種進(jìn)行多態(tài)性分析，并利用聚類分析法對樣品的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析。馬林等[9]成功將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，建立了12個煙草品種的鑒別路線。王貴[10]利用RAPD和SCAR標(biāo)記技術(shù)成功篩選出2個與馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)抗性相關(guān)的分子標(biāo)記。蘇凱等[11]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對貴州38個煙草黑脛病菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，探索不同種植區(qū)病菌的遺傳分化關(guān)系。

目前，RAPD指紋圖譜分析方法包括聚類分析法、電泳譜帶數(shù)據(jù)庫法、二元表法和人工繪制品種樹圖(MCID)法等[12]。聚類分析法雖是較常用的分析方法，但僅表示出品種間的遺傳關(guān)系，在實際鑒定過程中直觀性較差，實踐性較弱；電泳譜帶數(shù)據(jù)庫法由于凝膠成像過程中所調(diào)參數(shù)不同，實際電泳圖譜與電泳數(shù)據(jù)庫中保存電泳圖譜的一致性存在差異，因此實踐性也較低；二元表法構(gòu)建指紋圖譜是目前最為常用的分子鑒定方法，在煙草鑒定中已得到廣泛應(yīng)用[13-14]；MCID法是一種新的指紋圖譜分析方法，在林木、蔬菜、水果品種鑒別中應(yīng)用較為廣泛[15-21]。許園園等[18]利用篩選出的4個RAPD引物，成功繪制出20個蘿卜品種的MCID。王玉娟等[19]篩選出6條RAPD引物，利用MCID法對72個葡萄品種進(jìn)行鑒別。ZHAO等[20]利用篩選出的RAPD引物，繪制出46個草莓品種的MCID，成功對46個草莓品種進(jìn)行鑒別。以往煙草品種鑒定研究多使用二元表法，MCID法在煙草鑒定領(lǐng)域鮮有報道。因此，本研究利用RAPD分子標(biāo)記構(gòu)建13個煙草品種的DNA指紋圖譜，分別采用二元表法和MCID法對DNA指紋圖譜進(jìn)行分析，通過對比2種分析方法的優(yōu)劣，建立一套合理的煙草品種鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑、儀器

1.1.1 材料 13個煙草品種來自鄭州輕工業(yè)學(xué)院煙草生物技術(shù)研究室，具體見表1。煙苗長至五葉一心時采集煙葉樣品，并于液氮速凍后放至-80 ℃超低溫冰箱保存。

表1 供試13個煙草品種的名稱及其編號 Tab.1 The names and numbers of 13 tobacco varieties used in this study

1.1.2 試劑 磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒購自洛陽惠爾納米科技有限公司；2×TaqPlus Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RAPD引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.1.3 儀器 全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)、NanoDrop ND-2000C超微量分光光度計(賽默飛世爾科技公司)、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)、Vetiti型梯度PCR儀(美國ABI公司)、Mini Bis Pro型凝膠成像分析系統(tǒng)(以色列DNR凝膠成像系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取幼嫩葉片約0.2 g，用快速研磨儀將樣品磨碎。利用磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒提取煙草基因組DNA，操作過程及試劑用量均以試劑說明書為準(zhǔn)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度，將DNA稀釋至50 ng/μL置于-20 ℃保存。

1.2.2 特異性引物篩選 利用實驗室建立的RAPD-PCR反應(yīng)體系和程序?qū)铣傻?50條隨機引物進(jìn)行特異性篩選，并對特異性較好的隨機引物進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，篩選出重復(fù)性好、特異性高、條帶清晰穩(wěn)定的隨機引物，用于煙草品種鑒定。

1.2.3 RAPD-PCR擴增反應(yīng) RAPD-PCR反應(yīng)體系：50 ng/μL模板DNA 1 μL，2×TaqPlus Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物1 μL，ddH2O補至25 μL。RAPD-PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性50 s，退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。

1.2.4 擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析 PCR擴增產(chǎn)物在85 V條件下于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳40 min，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.2.5 二元表法分析DNA指紋圖譜 根據(jù)特異性隨機引物凝膠成像結(jié)果，當(dāng)某煙草品種在特異性位點有特異性條帶時，記錄為“1”，當(dāng)某品種在特異性位點無特異性條帶時，記錄為“0”，最終由“0”“1”形成每個品種特定的分子ID。

1.2.6 MCID法分析DNA指紋圖譜 根據(jù)特異性隨機引物凝膠成像結(jié)果，在某一隨機引物的參與下，將能擴增出相同特異性條帶的品種歸為同一組，如果有品種擴增出自身獨有的特異性條帶，則該品種被鑒定出來；之后在小組內(nèi)逐一用其他特異性引物進(jìn)行鑒別，直至所有的品種被鑒定出。最后人工繪制植物品種鑒別簡圖，并在圖中注明引物編號和特異性條帶的位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草DNA的提取

利用磁珠法提取13個煙草品種DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1 所示。從圖1可以看出，提取的煙草基因組DNA條帶清晰，無明顯雜帶和拖尾出現(xiàn)，可用于后續(xù)試驗。

1—13:材料編號，下同1—13:Numbers of tobacco varieties.The same below圖1 13個煙草品種基因組DNA的凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Genomic DNA electrophoresis patterns of 13 tobacco varieties

2.2 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

從合成的150條隨機引物中共篩選出28條能產(chǎn)生特異性條帶的隨機引物，并對其退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，其中，S29、S42、S301、L189等4條隨機引物的特異性較高，能產(chǎn)生穩(wěn)定且清晰的特異性條帶，具體見表2。

表2 RAPD引物及退火溫度Tab.2 RAPD primers and their annealing temperature

2.3 RAPD-PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

利用篩選出的特異性較強的引物S29、S42、S301、L189對13個煙草品種進(jìn)行RAPD-PCR擴增，所得產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳40 min，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，有穩(wěn)定清晰的特異性條帶出現(xiàn)(圖2—5)。

M：DNA marker DL2000，下同 M：DNA marker DL2000.The same below圖2 引物S29擴增的13個煙草品種指紋圖譜 Fig.2 The banding patterns of 13 tobacco varieties amplified by primer S29

圖3 引物S42擴增的13個煙草品種指紋圖譜 Fig.3 The banding patterns of 13 tobacco varieties amplified by primer S42

圖4 引物S301擴增的13個煙草品種指紋圖譜 Fig.4 The banding patterns of 13 tobacco varieties amplified by primer S301

圖5 引物L(fēng)189擴增的13個煙草品種指紋圖譜 Fig.5 The banding patterns of 13 tobacco varieties amplified by primer L189

2.4 構(gòu)建二元表快速鑒定煙草品種

據(jù)圖2可知，引物S29在620、950、1 000、1 200 bp處能擴增出4條特異性條帶。在620 bp處，5號、11號和12號品種特異性條帶缺失，記為“0”，其余品種記為“1”；在950 bp處，僅7號品種出現(xiàn)特異性條帶，記為“1”，其余品種記為“0”，7號品種被鑒定出來；在1 000 bp處，1號、2號、4號、6號、10號、13號有特異性條帶出現(xiàn)，記為“1”，其余品種記為“0”；在1 200 bp處，僅13號品種擴增出特異性條帶，記為“1”，其余品種記為“0”，13號品種被鑒定出來。

由圖3可知，引物S42在980、2 000、2 500 bp處能產(chǎn)生有效的特異性擴增。在980 bp處，1號、4號、8號品種特異性條帶缺失，則記為“0”，其余品種記為“1”，8號品種被鑒定出來；在2 000 bp處，5號、9號、12號品種有特異性條帶出現(xiàn)，記為“1”，其余品種記為“0”，3號、9號、10號品種被鑒定出來；在2 500 bp處，5號、6號、9號、11號、12號、13號有特異性條帶出現(xiàn)，記為“1”，其余品種記為“0”，6號品種被鑒定出來。

由圖4可知，引物S301在750 bp和2 050 bp處能產(chǎn)生有效的特異性擴增。在750 bp處，6號、9號、10號品種能產(chǎn)生特異性條帶，記為“1”，其余品種記為“0”，2號和10號品種被鑒定出來；在2 050 bp處，1號、6號、8號、9號品種能產(chǎn)生特異性條帶，則記為“1”，其余品種記為“0”，1號和4號品種被鑒定出來。

由圖5可知，引物L(fēng)189在750 bp處能產(chǎn)生有效的特異性條帶，5號、6號、7號、8號、11號品種該特異性條帶消失，記為“0”，其余品種記為“1”，5號和12號品種被鑒定出來。

最終構(gòu)建的由“0”“1”組成的二元分子ID表如表3所示。

表3 供試13個煙草品種的分子ID Tab.3 Molecular ID of 13 tobacco varieties

2.5 利用MCID法快速鑒定煙草品種

由引物S29對13個煙草品種擴增的DNA指紋圖譜(圖2)可知，根據(jù)620、950、1 000、1 200 bp處4條特異性條帶的有無可將13個煙草品種分為5組，出現(xiàn)特異性條帶時用(+)表示，缺失特異性條帶時用(-)表示。第1組為620 bp(+)、950 bp(-)、1 000 bp(+)和1 200 bp(-)，包含1號、2號、4號、6號和10號5個品種；第2組為620 bp(+)、950 bp(-)、1 000 bp(-)和1 200 bp(-)，包含3號、8號、9號3個品種；第3組為620 bp(-)、950 bp(-)、1 000 bp(-)和1 200 bp(-)，包含5號、11號、12號3個品種；第4組為620 bp(+)、950 bp(+)、1 000 bp(-)和1 200 bp(-)，僅包括7號品種，因而7號品種(延曬7號)被單獨鑒定出來；第5組為：620 bp(+)、950 bp(-)、1 000 bp(+)和1 200 bp(+)，僅包括13號品種，因此13號品種(GR17)被鑒定出來。

針對第1組5個品種來說，由引物S42擴增的DNA指紋圖譜(圖3)可知，根據(jù)980、2 000、2 500 bp處3條特異性條帶的有無可以將第1組的5個煙草品種分為3組，第1亞組為：980 bp(-)、2 000 bp(-)和2 500 bp(-)，包含1號和4號2個品種；第2亞組為：980 bp(+)、2 000 bp(-)和2 500 bp(-)，包含2號和10號2個品種；第3亞組為：980 bp(+)、2 000 bp(-)和2 500 bp(+)，僅有6號品種，因此6號品種(云煙202)被鑒定出來。再用引物S301對第1、2亞組進(jìn)行區(qū)分，第1亞組中4號品種在750 bp和2 050 bp處均無特異性擴增，而1號品種在2 050 bp處有特異性擴增，則1號和4號品種被分別鑒定出來；第2亞組中，在750 bp處2號品種無特異性擴增，10號品種有特異性擴增，2號和10號品種被鑒定出來。另外2組按照類似的鑒定方法進(jìn)行鑒定，直至將組內(nèi)所有的品種鑒別開。最后，結(jié)合所用引物及擴增的特異性條帶信息繪制所有煙草品種的鑒定簡圖，即人工繪制的煙草品種鑒別簡圖(圖6)。

(+)表示有特異性條帶；(-)表示缺失特異性條帶 (+) represents specific band; (-) represents no specific band圖6 4個隨機RAPD引物鑒別區(qū)分13個煙草品種的MCID Fig.6 MCID of the 13 tobacco varieties identified by 4 random RAPD primers

3 結(jié)論與討論

利用二元表建立品種分子ID對煙草品種進(jìn)行鑒定，在分析電泳結(jié)果時，用“1”“0”表征特征條帶的“有”“無”，形成不同的排列組合，構(gòu)成不同品種的分子ID。但隨著待測品種數(shù)量的不斷增加，“1”“0”矩陣復(fù)雜程度增加，對比鑒別工作量增大，直觀可讀性大大降低。利用MCID法鑒定煙草品種，在分析電泳結(jié)果時，不同品種根據(jù)某引物擴增出的特異性條帶有無的組合情況被分到不同的小組中，之后又將每一小組作為新的研究對象進(jìn)行鑒別分組，直至所有的品種被鑒定出。由于MCID法不斷把有相同特征譜帶的品種劃為1個小組，不斷縮小研究范圍，具有較強的操作性，克服了二元表法在鑒定分析大量品種時的不足，可用于大量品種的鑒定分析；同時，MCID法具有較強的融入功能，新品種加入后，當(dāng)樹圖上已有的特異性引物能將其與圖中已有品種區(qū)分開時，只需將其指紋信息加入到樹圖中，當(dāng)原有引物無法滿足需要時，則需要篩選新的特異性引物進(jìn)行特異性區(qū)分，工作量不大。因此，當(dāng)鑒定品種較少時，二元表法和MCID法2種方法都可方便地鑒定不同品種；但當(dāng)鑒別品種較多時，MCID法更加直觀，可操作性也更強，這與許圓圓等[18]的觀點相一致。

本試驗為克服RAPD分子標(biāo)記技術(shù)穩(wěn)定性差的缺點，經(jīng)過3次重復(fù)試驗，篩選出28條重復(fù)性好、多態(tài)性高的隨機引物，又通過退火溫度優(yōu)化從中篩選出4條穩(wěn)定性好的RAPD引物作為標(biāo)記引物，成功對13個煙草品種進(jìn)行特異性分子標(biāo)記。結(jié)果顯示，二元表法和MCID法都能直觀地呈現(xiàn)出13個煙草品種的鑒定結(jié)果。當(dāng)供試品種較多時，MCID法由于可添加性和直觀性較好，更具實際操作價值，可在煙草行業(yè)中用于大量煙草品種的快速鑒定。