， ， ，， ， ，， ，生祥

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)作物研究所，寧夏 銀川 750001)

小麥(TriticumaestivumL.)是一種適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣泛的世界性糧食作物，為全球35%～40%人口提供主糧。我國(guó)是世界上最大的小麥生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，小麥年生產(chǎn)總量和消耗總量占世界小麥年生產(chǎn)總量的17%和消費(fèi)總量的16%，小麥生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展對(duì)保障國(guó)家糧食安全具有重要意義[1]。隨著人民生活水平的提高，對(duì)小麥品質(zhì)的要求也逐漸提高，而我國(guó)小麥蛋白質(zhì)含量平均為13.94%，面筋含量平均為30.40%，沉降值平均為32.10 mL，遠(yuǎn)不能滿足人們的需求[2]。其中，蛋白質(zhì)含量是小麥營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)最重要的一項(xiàng)指標(biāo)，而蛋白質(zhì)質(zhì)量由面筋含量、沉降值、流變學(xué)特性等加工品質(zhì)決定[3]。因此，對(duì)于我國(guó)小麥品質(zhì)改良來說，不僅要提高籽粒的蛋白質(zhì)含量，更要改善和提高小麥加工品質(zhì)[4-5]。蛋白質(zhì)性狀為小麥品質(zhì)性狀中的代表性性狀，其貢獻(xiàn)率比較大[6-7]。SHEWRY等[8]認(rèn)為，表達(dá)的半胱氨酸肽酶基因數(shù)目與高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基(High molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)總量存在劑量關(guān)系，即小麥品質(zhì)的改良可通過增加HMW-GS數(shù)目來實(shí)現(xiàn)；而低分子質(zhì)量谷蛋白亞基(Low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS)數(shù)量及HMW-GS、LMW-GS組合也對(duì)品質(zhì)性狀有重大影響[9]。另外，HMW-GS的1、2*、17+18、5+10亞基和LMW-GS的GluA3f、GluB3b、GluB3g亞基與面團(tuán)形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間均呈顯著正相關(guān)，HMW-GS的N、1、14+15、17+18、7+8、2+12、3+12、4+12亞基和LMW-GS的GluB3d、GluB3f、GluB3h、GluB3g亞基與蛋白質(zhì)和濕面筋含量均呈顯著正相關(guān)[10]。因此，HMW-GS、LMW-GS的數(shù)目及組合形式直接決定小麥品質(zhì)的優(yōu)劣。

DNA分子標(biāo)記和QTL定位技術(shù)的發(fā)展為小麥品質(zhì)性狀的分子檢測(cè)提供了有效的方法。目前，利用分子標(biāo)記對(duì)小麥不同群體的蛋白質(zhì)含量、沉降值、淀粉含量等品質(zhì)性狀進(jìn)行了大量研究[11-14]。同時(shí)，在QTL發(fā)掘方面，孫海艷等[15]共發(fā)現(xiàn)了15個(gè)分布在1D、3B、6D染色體上的蛋白質(zhì)品質(zhì)性狀QTL。解樹斌[16]發(fā)掘了涉及籽粒蛋白質(zhì)含量的33個(gè)QTL，分布在1A、1B、4A、4B、6A染色體上，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為6.69%～15.52%，LOD值最大為7.3，同時(shí)，檢測(cè)到涉及沉淀值的33個(gè)QTL，分布在1A、1B、4B、5B、5D、6A、6D染色體上，單個(gè)QTL表型貢獻(xiàn)率為4.62%～18.73%，LOD值最大為13.6。李紅民[17]檢測(cè)到1個(gè)控制小麥籽粒硬度的主效QTL，LOD值為10。郭利建等[18]檢測(cè)到33個(gè)與品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL，其中,11個(gè)為粗蛋白含量QTL，分布在1A、3A、5A、6A、2B、4B染色體上，表型貢獻(xiàn)率為0.69%～2.48%；12個(gè)為濕面筋含量QTL，分布在1A、3A、5A、6A、2B、3B、4B染色體上，表型貢獻(xiàn)率為0.58%～2.37%；3個(gè)為沉降值QTL，分布在3A、1B、3B染色體上，表型貢獻(xiàn)率為2.72%～11.31%。雖然小麥品質(zhì)相關(guān)性狀的QTL研究已有許多報(bào)道，但在育種上有利用價(jià)值的相關(guān)QTL還有待研究和應(yīng)用。本研究針對(duì)寧夏回族自治區(qū)主栽小麥品種寧春4號(hào)綜合農(nóng)藝性狀、適應(yīng)性好，但品質(zhì)一般，而育成于山西運(yùn)城的河?xùn)|烏麥籽粒蛋白質(zhì)含量、面筋含量、沉降值均較高，在前期對(duì)2個(gè)小麥品種遺傳性狀與分子標(biāo)記分析的基礎(chǔ)上[19]，構(gòu)建了雜交組合群體，對(duì)其F2進(jìn)行品質(zhì)性狀及其分子標(biāo)記分析，以期為寧夏回族自治區(qū)小麥品質(zhì)性狀改良發(fā)掘可供利用的育種中間材料和QTL。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

寧春4號(hào)為寧夏回族自治區(qū)主栽小麥品種，河?xùn)|烏麥由運(yùn)城學(xué)院杜磊博士提供。2016年在寧夏大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)對(duì)寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥進(jìn)行正反交，同年將收獲的雜交種子在云南南繁加代，2017年將收獲種子種植于寧夏大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，單粒點(diǎn)播，每行10粒，行長(zhǎng)1.1 m，行寬0.2 m，獲得含331個(gè)單株的F2群體，其中正交后代201株(編號(hào)001—007、013—206)，反交后代130株(編號(hào)008—012、207—331)。

1.2 小麥品質(zhì)性狀的測(cè)定

用瑞典波通9200整粒谷物紅外線分析儀測(cè)定籽粒含水量、硬度、蛋白質(zhì)含量、沉降值、面筋含量[20]，在國(guó)家小麥改良中心西北分中心進(jìn)行。

1.3 小麥品質(zhì)性狀的分子標(biāo)記分析

基因組DNA的提取采用SDS法[21]。前期根據(jù)小麥的7個(gè)部分同源群設(shè)計(jì)了SSR標(biāo)記，本研究利用能夠在寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥間穩(wěn)定擴(kuò)增的49個(gè)SSR標(biāo)記[19]進(jìn)行分析，其中對(duì)本研究材料品質(zhì)性狀有明確QTL定位結(jié)果的5個(gè)SSR標(biāo)記的名稱及序列見表1。2個(gè)分別與HMW-GS數(shù)目和面粉核黃素含量相關(guān)的標(biāo)記Bx17、YP7A參照文獻(xiàn)[22-23]，具體信息見表1。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 SSR標(biāo)記信息

PCR反應(yīng)體系：10×Reaction Buffer 1 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.8 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)0.8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA 100 ng，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.05 μL，加ddH2O至總體積10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56～58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳時(shí)總電壓為180 V，電泳約1.5 h，經(jīng)銀染后觀察、照相，并統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013對(duì)品質(zhì)性狀和分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；用SPSS 20進(jìn)行方差、相關(guān)性和聚類分析；利用Origin 8.0對(duì)各品質(zhì)性狀的頻率分布進(jìn)行作圖；采用Map Manager QTXb 20進(jìn)行QTL定位，取概率值P<0.05的LOD值作為判斷QTL存在的閾值，利用Kosambi函數(shù)中單標(biāo)記回歸分析方法進(jìn)行QTL分析，即檢測(cè)親本間有多態(tài)性的引物在F2群體中的分布，根據(jù)電泳譜帶結(jié)果建立SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)庫：與母本相同的帶型記為B，與父本相同的帶型記為A，雜合帶型記為H，缺失記為-。將331個(gè)F2單株的分子標(biāo)記結(jié)果與品質(zhì)性狀數(shù)據(jù)相結(jié)合，運(yùn)用Map Manager QTXb 20軟件檢測(cè)相關(guān)QTL位點(diǎn)，QTL命名方法為：小寫字母q+目標(biāo)性狀的大寫英文字母代稱+所在染色體號(hào)數(shù)，QTL全稱通常用斜體表示，如在5B染色體上，與穗長(zhǎng)相關(guān)的QTL位點(diǎn)命名為qSL5B。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交F2品質(zhì)性狀分析

2.1.1 品質(zhì)性狀變異分析 對(duì)寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交F2的331個(gè)單株的5個(gè)品質(zhì)性狀進(jìn)行分析(圖1)發(fā)現(xiàn)，5個(gè)品質(zhì)性狀在F2均出現(xiàn)較大分離，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，均呈連續(xù)正態(tài)分布，符合多基因控制的數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)，并且出現(xiàn)了許多具有超親性狀的單株。

對(duì)F2群體品質(zhì)性狀進(jìn)行變異分析(表2)發(fā)現(xiàn)，籽粒蛋白質(zhì)含量、硬度、面筋含量和沉降值的群體平均值均超過高親親本，含水量的群體平均值介于高親親本與低親親本之間。其中，含水量、蛋白質(zhì)含量、面筋含量、硬度、沉降值的超中親比例分別達(dá)77.78%、84.52%、92.46%、73.41%、99.60%，超高親比例分別達(dá)46.63%、82.94%、90.48%、66.27%、99.60%。5個(gè)品質(zhì)性狀的變異系數(shù)表現(xiàn)為沉降值(39.54%)>面筋含量(19.91%)>硬度(17.10%)>蛋白質(zhì)含量(12.63%)>含水量(3.87 %)。

圖1 寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交F2品質(zhì)性狀頻率分布Fig.1 Frequency distribution of quality traits in F2 hybrids from Ningchun No.4 and Hedong black wheat

品質(zhì)性狀Quality traits寧春4號(hào)Ningchun No.4河?xùn)|烏麥Hedong black wheat變異幅度Variation range平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)差Standard deviation變異系數(shù)/%Coefficient of variationF超中親比例/%Proportion ofultra-mid parent超高親比例/%Proportion of ultra-high parent含水量/%Water content 10.0110.759.59～11.8310.720.423.8729.533??77.7846.63蛋白質(zhì)含量/%Protein content 12.5612.7210.70～18.9014.711.8612.6344.511??84.5282.94面筋含量/%Gluten content22.6924.0616.93～52.5932.036.3819.91748.126??92.4690.48硬度/%Hardness48.6445.4116.41～72.2150.988.7217.10788.502??73.4166.27沉降值/mLSedimentation value17.8817.9610.40～68.4534.7713.7539.54996.946??99.6099.60

注：**表示在 0.01水平上的變異。

Note：** means variation degree at 0.01 level.

2.1.2 基于品質(zhì)性狀的聚類分析 基于籽粒含水量、蛋白質(zhì)含量、面筋含量、硬度和沉降值5個(gè)品質(zhì)性狀對(duì)F2群體進(jìn)行聚類分析，在遺傳距離為10 cM時(shí)，F(xiàn)2群體被分成5個(gè)類群(圖2)，其中，含水量表現(xiàn)為Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ，蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ，面筋含量表現(xiàn)為Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ>Ⅰ，硬度表現(xiàn)為Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ，沉降值表現(xiàn)為Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ?？傮w上，類群Ⅰ單株平均沉降值最大(60.13 mL)，類群Ⅱ單株平均蛋白質(zhì)含量(17.26%)、面筋含量(38.78%)最高，類群Ⅲ單株平均蛋白質(zhì)含量、面筋含量、沉降值也較高，分別為16.42%、37.75%、48.24 mL；類群Ⅴ單株平均含水量(10.90%)、硬度(54.23%)最大。

圖2 寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交F2 5個(gè)類群的品質(zhì)性狀

2.1.3 品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析 對(duì)F2群體的5個(gè)品質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析(表3)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)含量與面筋含量(r為0.94)、沉降值(r為0.93)均呈極顯著正相關(guān)，與含水量(r為-0.30)、硬度(r為-0.18)均呈極顯著負(fù)相關(guān)；含水量與硬度(r為0.49)呈極顯著正相關(guān)，與面筋含量(r為-0.29)、沉降值(r為-0.35)均呈極顯著負(fù)相關(guān)；面筋含量與沉降值(r為0.89)呈極顯著正相關(guān)；硬度與沉降值(r為-0.27)呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表3 寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交F2品質(zhì)性狀相關(guān)性分析

注： **表示在0.01水平上極顯著相關(guān)。

Note：** means significant correlation at 0.01 level.

2.2 寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交F2品質(zhì)性狀分子標(biāo)記分析

2.2.1 品質(zhì)性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔助選擇 利用在親本間有差異的2個(gè)分別與HMW-GS數(shù)目和面粉核黃素含量相關(guān)的標(biāo)記Bx17和YP7A，對(duì)其在F2群體中的分布情況進(jìn)行檢測(cè)(圖3、表4)發(fā)現(xiàn)，331個(gè)單株中，有233個(gè)單株攜帶Bx17基因，占群體總數(shù)的70.39%；有294個(gè)單株攜帶Psy-A1基因，占總數(shù)的88.82%；有206個(gè)單株同時(shí)攜帶Bx17和Psy-A1基因，占總數(shù)的62.24%。

M：DL2000；W：空白對(duì)照；P1：寧春4號(hào)；P2：河?xùn)|烏麥；1—331：F2單株M:DL2000;W:Blank control;P1:Ningchun No.4;P2:Hedong black wheat;1—331:F2 individual plants圖3 標(biāo)記Bx17在寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交F2中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of Bx17 in F2 hybrids from Ningchun No.4 and Hedong black wheat

標(biāo)記名稱Marker name基因Genes性狀Traits株數(shù)Plant numberBx17Bx17HMW-GS數(shù)目233YP7APsy-A1面粉核黃素含量294Bx17/YP7ABx17/Psy-A1HMW-GS數(shù)目/面粉核黃素含量206

2.2.2 品質(zhì)性狀的QTL定位 利用能夠在寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥間穩(wěn)定擴(kuò)增的49個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)F2群體進(jìn)行檢測(cè)，其中，5個(gè)標(biāo)記對(duì)品質(zhì)性狀有明確的QTL定位結(jié)果(表5)，這5個(gè)標(biāo)記共檢測(cè)到8個(gè)與品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL，表型貢獻(xiàn)率為3%～5%，LOD值最大為9.40，涉及5A、1B、5B、7B、5D等5條染色體。其中，共檢測(cè)到2個(gè)蛋白質(zhì)含量QTL位點(diǎn)，分布在2條染色體上(1B、5D)，加性效應(yīng)分別為-0.42、0.23，LOD值最大為7.60；共檢測(cè)到1個(gè)含水量QTL位點(diǎn)，分布在7B染色體上，加性效應(yīng)為-0.04，LOD值為7.20；共檢測(cè)到1個(gè)面筋含量QTL位點(diǎn)，分布在1B染色體上，加性效應(yīng)為-1.62，LOD值為9.40；共檢測(cè)到2個(gè)硬度QTL位點(diǎn)，分布在2條染色體上(5A、5B)，加性效應(yīng)分別為-2.93、-1.95，LOD值最大為9.40；共檢測(cè)到2個(gè)沉降值QTL位點(diǎn)，分布在2條染色體上(1B、5D)，加性效應(yīng)分別為-2.95、1.86，LOD值最大為7.50。綜上，1B染色體上檢測(cè)到蛋白質(zhì)含量、面筋含量和沉降值QTL，5D染色體上檢測(cè)到蛋白質(zhì)含量和沉降值QTL，這2條染色體存在不同品質(zhì)性狀的QTL富集區(qū)。

表5 寧春4號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交F2品質(zhì)性狀QTL分析

3 結(jié)論與討論

長(zhǎng)期以來，高產(chǎn)作為小麥育種的基本目標(biāo)，要求親本具有較高產(chǎn)量水平[24]。高蛋白質(zhì)含量是品種選育的另一要求。親本選配時(shí)要求雙親之一的蛋白質(zhì)含量高，而另一親本在這方面不應(yīng)過低[25-27]；蛋白質(zhì)含量的遺傳力較高，變異受環(huán)境影響較小，應(yīng)從早期世代開始進(jìn)行選擇[28-31]。F2群體是早期世代選擇的理想群體，各遺傳性狀處于高度分離狀態(tài)，能夠提供最大的數(shù)量遺傳信息。本研究表明，5個(gè)品質(zhì)性狀在F2群體中均出現(xiàn)較大分離，達(dá)到極顯著水平，均呈連續(xù)正態(tài)分布；蛋白質(zhì)含量、面筋含量、硬度、沉降值的群體平均值均超過高親親本，超高親比例分別達(dá)82.94%、90.48%、66.27%、99.60%，含水量的群體平均值介于高親親本與低親親本之間，超中親比例達(dá)77.78%，超高親比例達(dá)46.63%；類群Ⅱ、類群Ⅲ的蛋白質(zhì)含量、面筋含量和沉降值均較高，為優(yōu)質(zhì)類群；蛋白質(zhì)含量與面筋含量和沉降值、含水量與硬度、面筋含量與沉降值均呈極顯著正相關(guān)，而蛋白質(zhì)含量與含水量和硬度、含水量與面筋含量和沉降值、硬度與沉降值均呈極顯著負(fù)相關(guān)。育種實(shí)踐中，產(chǎn)量、品質(zhì)性狀、抗病性之間往往存在負(fù)相關(guān)性，品質(zhì)性狀各指標(biāo)間也存在或多或少的負(fù)相關(guān)性，很難做到各個(gè)性狀都達(dá)到設(shè)定的育種目標(biāo)，為此在擇優(yōu)選擇的同時(shí)，還要保持各性狀間的協(xié)調(diào)性。今后還需進(jìn)一步分析不同世代的品質(zhì)性狀及遺傳特性，以便更準(zhǔn)確地掌握品質(zhì)性狀的變異規(guī)律。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是根據(jù)基因組DNA存在豐富的多態(tài)性而發(fā)展起來的，可直接反映生物個(gè)體在DNA水平上的差異。分子標(biāo)記為小麥品質(zhì)性狀分析提供了新的遺傳標(biāo)記類型。近年來，利用分子標(biāo)記輔助選擇小麥蛋白質(zhì)相關(guān)基因的研究已取得了一定進(jìn)展[22-23,32-33]。本研究利用2個(gè)品質(zhì)性狀相關(guān)標(biāo)記Bx17和YP7A對(duì)F2331個(gè)單株進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， 233個(gè)單株攜帶Bx17基因，294個(gè)單株攜帶Psy-A1基因，206個(gè)單株同時(shí)攜帶Bx17和Psy-A1基因。同時(shí)，利用新開發(fā)的5個(gè)SSR標(biāo)記共檢測(cè)到8個(gè)不同品質(zhì)性狀QTL位點(diǎn)，涉及5A、1B、5B、7B、5D等5條染色體，加性效應(yīng)為-2.93～1.86，表型貢獻(xiàn)率為3%～5%，LOD值最大為9.40。同時(shí)，1B染色體上檢測(cè)到蛋白質(zhì)含量、面筋含量和沉降值3個(gè)性狀的QTL，5D染色體上檢測(cè)到蛋白質(zhì)含量和沉降值2個(gè)性狀的QTL，這2條染色體存在品質(zhì)性狀的QTL富集區(qū)，可作為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。本研究共檢測(cè)到蛋白質(zhì)含量QTL 2個(gè)，分布于1B、5D染色體上，表型貢獻(xiàn)率均為4%；含水量QTL 1個(gè)，分布于7B染色體上，表型貢獻(xiàn)率為4%；面筋含量QTL 1個(gè)，分布于1B染色體上，表型貢獻(xiàn)率為5%；硬度QTL 2個(gè)，分布于5A、5B染色體上，表型貢獻(xiàn)率分別為5%、4%；沉降值QTL 2個(gè)，分布在1B、5D染色體上，表型貢獻(xiàn)率分別為3%、4%。在今后研究中，還需進(jìn)一步開發(fā)高效的分子標(biāo)記，通過構(gòu)建高密度的物理圖譜，進(jìn)而使得與品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL(尤其是主效QTL)得以精細(xì)定位，為小麥重要品質(zhì)性狀QTL發(fā)掘、研究、應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。