錢龍梁 ，曹福亮 ，2，汪貴斌 ，2

（1.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014）

植物長(zhǎng)期在生物和非生物的相互作用影響下會(huì)產(chǎn)生一些次生代謝物。次生代謝物是指植物中由次生代謝（Secondary metablism）產(chǎn)生的一類植物生長(zhǎng)發(fā)育或者生命活動(dòng)正常運(yùn)行的非必需的小分子有機(jī)化合物。植物的次生代謝產(chǎn)物在植物的生命活動(dòng)多個(gè)方面起著重要的作用，而且許多植物的次生代謝產(chǎn)物是其生長(zhǎng)代謝所不可或缺的[1]。根據(jù)植物次生代謝物的性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)，一般將其分為3 大類:酚類（Phenolic）、含氮化合物（Nitrogen containing compound）和萜類（Terpene）[2]，而銀杏葉片里富含大量的次生代謝物，如黃酮類、酚類、萜類內(nèi)脂、類戊二烯類（甾醇和萜類）、喹啉類生物堿、p-植物外源凝集素等[3-4]，其中最具藥用活性的成份是銀杏黃酮類與萜類內(nèi)酯類。黃酮類物質(zhì)是一大類次生代謝物[5]，葉黃酮是次生代謝的結(jié)果,它的形成是以光合產(chǎn)物為基礎(chǔ)。銀杏葉片中含有重要的生理活性物質(zhì)——類黃酮，它具有擴(kuò)張血管、抑制血栓形成等療效，且藥負(fù)作用小，因此銀杏葉制劑在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)供不應(yīng)求[6]。本研究通過(guò)研究不同接穗品種和氣候?qū)︺y杏嫁接苗中葉黃酮含量的影響，系統(tǒng)研究影響銀杏嫁接苗葉中次生代謝物黃酮的合成因素。

1 試驗(yàn)地概況

3個(gè)試驗(yàn)地分別是廣東省云浮市前鋒鎮(zhèn)菜坑村、四川省達(dá)州市開江縣和云南省曲靖市沾益縣。前鋒鎮(zhèn)位于云浮市城區(qū)南面，112°05′E，22°49′N，海拔754 m，前鋒鎮(zhèn)屬南亞熱帶季風(fēng)氣候。累年平均氣溫21.3℃，降水量1 850 mm，霜日 7 d。開江縣地域介于 107°42′～ 108°05′E、30°47′～ 31°15′N 之間，平均海拔 700 m，開江縣境屬于中亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)，氣候溫和，熱量充足，四季分明，雨量豐沛，季風(fēng)氣候明顯，立體氣候突出。開江縣氣候溫潤(rùn)，雨量充沛，年均溫16.6 ℃，年降水量1 259.2 mm，年日照1 386.6 h，無(wú)霜期長(zhǎng)達(dá)282.6 d。云南省曲靖市沾益區(qū)沾益縣位于 103°58′E，25°52′N，其海拔2 100 m，全年氣候溫和，降水充沛，干濕季分明，屬低緯度高原季風(fēng)氣候。年平均氣溫16.3～18.6 ℃，極端最高溫33.1 ℃，極端最低溫-9.2 ℃，年日照時(shí)數(shù)2 098 h，日照率47%，全年無(wú)霜期255 d左右，年均降水量1 002 mm， 5—10月降水量占全年降水的89%。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2017年3年18日，從江蘇省邳州市陳樓鎮(zhèn)銀杏種質(zhì)資源圃選取4個(gè)品種的接穗，分別是古銀杏（葉豐）、泰興大佛指、27#（南京林業(yè)大學(xué)一品種）、57#（大花穗），每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)都嫁接這4種接穗品種，同一個(gè)試驗(yàn)地的砧木都是相同品種的3年生實(shí)生苗，每個(gè)品種的接穗都采自同一樹齡的銀杏樹上，3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)均由同一嫁接員采用劈接的嫁接方法進(jìn)行嫁接，由于3個(gè)地距離較遠(yuǎn)，故嫁接時(shí)間前后相差1～2 d，且同一品種的接穗長(zhǎng)短、粗細(xì)基本一致，接穗長(zhǎng)15 cm，直徑為5 mm，所有接穗均是雙芽。由于接穗數(shù)量有限，故在廣東嫁接古銀杏60株、泰興大佛指90株、27#和57#各120株；在云南嫁接古銀杏30株、泰興大佛指60株、27#和57#各120株；在四川嫁接古銀杏30株、泰興大佛指60株、27#和57#各120株。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的每個(gè)品種均有3個(gè)重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，嫁接后3個(gè)地方的水肥管理均按照嫁接員提供的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)施。

2.2 樣品采集

2017年5年份分別去統(tǒng)計(jì)3個(gè)地方的嫁接存活率，8月和9月初分別在與砧木接合點(diǎn)上方 10 cm處有效芽抽出來(lái)的接穗一級(jí)分枝的上、中、下3個(gè)部位采取3～5葉，所有葉樣均采用干冰保存帶回后放入-193 ℃的超低溫冰箱保存，用于后期測(cè)黃酮。

2.3 黃酮含量測(cè)定及方法

采用索氏提取和高效液相色譜[7-9]，測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照樣品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，分別計(jì)算槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量，按下式換算成總黃酮醇苷的含量：

本樣品按干燥品計(jì)算，含總黃酮苷不得少于0.40%。色譜柱條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 19.0軟件中的Duncan 法對(duì)差異顯著指標(biāo)進(jìn)行方差分析[10]。

3 結(jié)果與分析

3.1 接穗品種、試驗(yàn)地對(duì)銀杏嫁接苗葉片中槲皮素含量的影響

不同接穗品種嫁接在同一個(gè)地方對(duì)銀杏中槲皮素含量的影響表現(xiàn)出顯著性差異。8月份4種接穗在廣東、云南、四川嫁接后均表現(xiàn)出顯著性差異，且均是古銀杏這個(gè)品種的葉片中槲皮素含量最高，分別為0.622、0.672、0.488 mg/g；在云南、四川兩地均是27#銀杏葉片中槲皮素含量最低，分別為0.474、0.282 mg/g，而在廣東則是57#槲皮素含量最低，含量為0.405 mg/g。9月份4種接穗品種在廣東、云南嫁接后均表現(xiàn)顯著性差異，且含量最高的均是古銀杏，分別為0.521、0.876 mg/g，含量最低的均是57#，含量分別為0.306、0.451 mg/g。但在四川，古銀杏、泰興大佛指均與27#、57#兩者呈顯著差異，而27#與57#兩者之間未出現(xiàn)呈顯著差異。在廣東地區(qū)槲皮素含量最高的是泰興大佛指，為0.632 mg/g，含量最低的是27#，為0.415 mg/g。

表1 不同品種嫁接在同一地方對(duì)銀杏葉中槲皮素含量的影響?Table 1 Effects of different varieties grafted in the same tested site on quercetin contents of G.biloba leaves

3.2 接穗品種、試驗(yàn)地對(duì)銀杏嫁接苗葉片中山奈酚素含量的影響

不同接穗品種嫁接在同一個(gè)地方對(duì)銀杏中山奈酚素含量的影響表現(xiàn)出顯著性差異。8月份4種接穗在廣東、四川嫁接后均表現(xiàn)出顯著性差異，且均是古銀杏這個(gè)品種的葉片中山奈酚素含量最高，分別為0.596和0.574 mg/g，在廣東含量最低是57#，而在四川含量最低是27#，含量分別為0.326和0.224 mg/g；在云南則表現(xiàn)為古銀杏和27#分別與泰興大佛指、57#均呈現(xiàn)顯著性差異，而泰興大佛指與57#兩者之間卻未出現(xiàn)顯著性差異，其中含量最高的是古銀杏，含量最低的是27#，分別為0.777和0.401 mg/g。9月份接穗品種在廣東、云南、四川嫁接后均表現(xiàn)顯著性差異，且在廣東、云南含量最高的均是古銀杏，分別為0.520、0.999 mg/g，在四川含量最高的是泰興大佛指，為0.572 mg/g，在廣東、云南和四川含量最低的均是57#，含量分別為 0.301、0.422、0.330 mg/g。

表2 不同品種嫁接在同一地方對(duì)銀杏葉中山奈酚素含量的影響Table 2 Effects of different varieties grafted in the same tested site on naikanapolil contents of G.biloba leaves

3.3 接穗品種、試驗(yàn)地對(duì)銀杏嫁接苗葉片中異鼠李素含量的影響

不同接穗品種嫁接在同一個(gè)地方對(duì)銀杏中異鼠李素含量的影響表現(xiàn)出顯著性差異。8月份在廣東，古銀杏、泰興大佛指均與27#、57#均呈現(xiàn)顯著性差異，后兩個(gè)品種間未出現(xiàn)顯著差異，4個(gè)接穗品種中異鼠李素含量最高的是泰興大佛指，含量最低的是古銀杏，含量分別為0.159和0.092 mg/g；在云南，古銀杏、27#分別與泰興大佛指、57#呈現(xiàn)顯著性差異，4個(gè)接穗品種中異鼠李素含量最高的是泰興大佛指，含量最低是古銀杏，含量分別為0.167和0.082 mg/g；在四川，則表現(xiàn)為古銀杏分別與泰興大佛指、27#、57#呈現(xiàn)顯著性差異，而后3個(gè)品種之間卻未出現(xiàn)顯著性差異，其中含量最高的是泰興大佛指，含量最低的是古銀杏，分別為0.093和0.056 mg/g。9月份4種接穗品種在廣東嫁接后表現(xiàn)古銀杏、57#分別與泰興大佛指、27#呈現(xiàn)顯著性差異，而后兩者之間未出現(xiàn)顯著差異，4個(gè)品種中異鼠李素含量最高的是27#，含量最低的是古銀杏，含量分別為0.129和0.080 mg/g；在云南，泰興大佛指、27#分別與古銀杏、57#呈現(xiàn)顯著性差異，后兩個(gè)品種之間卻未出現(xiàn)顯著差異，其中含量最高的是泰興大佛指，最低的是古銀杏，含量分別為0.158、0.112 mg/g，在四川，古銀杏、泰興大佛指分別與27#、57#呈現(xiàn)顯著性差異，而后兩者間未出現(xiàn)顯著性差異，異鼠李素含量最高的是泰興大佛指，最低的是古銀杏，含量分別為0.144、0.071 mg/g。

表3 不同品種嫁接在同一地方對(duì)銀杏葉中異鼠李素含量的影響Table 3 Effects of different varieties grafted in the same tested site on isorhamnetin contents of G.biloba leaves

3.4 接穗品種、試驗(yàn)地對(duì)銀杏嫁接苗葉片中總黃酮含量的影響

不同接穗品種嫁接在同一個(gè)地方對(duì)銀杏中山總黃酮含量的影響表現(xiàn)出顯著性差異。8月份4種接穗在云南、四川嫁接后均表現(xiàn)出顯著性差異，且均是古銀杏這個(gè)品種的葉片中總黃酮含量最高，分別為3.827和2.794 mg/g，含量最低的均是27#，分別為2.552和1.501 mg/g；在廣東則表現(xiàn)為古銀杏和泰興大佛指分別與27#、57#均呈現(xiàn)顯著性差異，而27#與57#兩者之間卻未出現(xiàn)顯著性差異，其中含量最高的是古銀杏，含量最低的是57#，分別為3.310和2.200 mg/g。9月份4種接穗品種在云南嫁接后均表現(xiàn)顯著性差異，而在廣東則表現(xiàn)為古銀杏和57#分別與泰興大佛指、27#均呈現(xiàn)顯著性差異，而27#與泰興大佛指兩者之間卻未出現(xiàn)顯著性差異，在四川表現(xiàn)為古銀杏和泰興大佛指分別與27#、57#均呈現(xiàn)顯著性差異，而27#與57#兩者之間卻未出現(xiàn)顯著性差異，廣東和云南兩個(gè)地方含量最高的均是古銀杏，分別為2.862、5.021，含量最低的均是57#，分別為1.812、2.505 mg/g，在四川含量最高的是泰興大佛指，為3.406 mg/g，含量最低的均是57#，含量分別為2.167 mg/g。

表4 不同品種嫁接在同一地方對(duì)銀杏葉中總黃酮含量的影響Table 4 Effects of different varieties grafted in the same tested site on flavonoids contents of G.biloba leaves

4 結(jié)論與討論

植物的次生代謝受到很多因素的影響，自身的品種對(duì)其次生的代謝物含量的影響最為顯著，其次氣候也是重要影響因素，次生代謝物種類繁多，而銀杏葉中的次生代謝物主要以黃酮為主。因此，黃酮含量的多少可以作為判斷銀杏葉用價(jià)值的高低的標(biāo)準(zhǔn)之一，所以選擇具有良好親和性的砧穗以及合適的種植地是提高嫁接銀杏葉中黃酮含量的關(guān)鍵因素之一[11-13]。本研究中，不同品種的銀杏葉中總黃酮及各組分含量有一定的差異[14]，相同品種接穗在不同地方嫁接后，銀杏葉片中總黃酮及黃酮各組分差異較大；相同地方不同品種接穗間差異也很大，黃酮含量的多少在一定程度上能反映該地區(qū)的環(huán)境條件的好壞，因?yàn)辄S酮的合成與PAL 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase）[15-16]有一定的聯(lián)系，而環(huán)境因素又會(huì)直接影響該酶的活性，PAL酶活性的降低導(dǎo)致類黃酮合成速率的下降[17]?？傮w上來(lái)說(shuō)，一定范圍內(nèi)，含有充足水分的試驗(yàn)地有利于總黃酮的積累，云南屬于高原，四季氣候適宜，溫度起伏不大，且雨水適宜，因此該地區(qū)的銀杏葉片中黃酮含量要明顯高于廣東和四川，而溫度變化過(guò)大以及雨水過(guò)多或過(guò)少均不利于黃酮各組分的累積，這與前人研究的適當(dāng)干旱脅迫能促進(jìn)葉內(nèi)黃酮含量增加幾乎一致[18]。因此，合適的接穗品種嫁接在合適的地方對(duì)銀杏葉片中次生代謝物的合成十分重要。

本研究?jī)H從黃酮含量方面研究了品種和氣候?qū)藿鱼y杏葉次生代謝的影響，由于銀杏葉中次生代謝物不僅僅于此，萜內(nèi)酯的含量也是增加葉用銀杏價(jià)值的重要指標(biāo)，因此品種和氣候?qū)藿鱼y杏葉中萜內(nèi)酯含量的影響有待進(jìn)一步深入研究。