薛瀟春，劉 芳，胡晉紅*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.解放軍第四五五醫(yī)院藥劑科，上海200052)

程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)是主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞上的共抑制受體[1]?；罨腡細(xì)胞通過PD-1與兩個特異性的配體——程序性死亡配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)及PD-L2結(jié)合，從而使T細(xì)胞失去活性、耗竭或凋亡[2]。銀屑病是活化的免疫細(xì)胞浸潤到皮膚后，引起表皮增生的慢性炎癥性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生銀屑病時，PD-1抗體組較未加阻斷的小鼠皮損癥狀加重，而PD-1敲除小鼠的皮損程度也較野生型小鼠嚴(yán)重[3]。重組 PD-L1蛋白可減輕銀屑病樣小鼠皮損及炎癥情況[4]。這些研究都表明PD-1/PD-L1通路在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

目前僅知銀屑病病人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)的PD-L1下調(diào)[5]，外周血單核細(xì)胞表達(dá)的PD-1上調(diào)[6]，其他免疫細(xì)胞中PD-L1和PD-1的表達(dá)未知。本研究用IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型，研究PD-1/PD-L1信號通路在銀屑病免疫細(xì)胞中的作用，探討該通路作為藥物靶點治療銀屑病的可行性。

1 材 料

1.1 儀器和試藥 流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)。IMQ乳膏(12.5 mg∶250 mg，新加坡INOVA 制藥有限公司)；pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS，上海博光生物科技有限公司)；紅細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)(美國Corning公司)； APC-anti-rat IgG2a kappa isotype control、FITC-anti-Armenian hamster IgG isotype control、FITC-anti-mouse CD11c、FITC-anti-mouse CD3、APC-anti-mouse B220 (美國BioLegend公司)；PE-anti-rat IgG2b kappa isotype control、PE-anti-mouse PD-L1、APC-anti-mouse CD4、PE-anti-mouse PD-1 (美國eBioscience公司)。

1.2 動物 8周齡BALB/c小鼠，雌雄各半，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2018-0006。實驗前，小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)1周，使其適應(yīng)環(huán)境。動物飼養(yǎng)期間，提供嚙齒類動物標(biāo)準(zhǔn)飲食，室溫18～25℃，濕度40%～70%，并確保12 h明暗周期。本方案遵守動物保護(hù)、動物福利及動物倫理的相關(guān)規(guī)定。

2 方 法

2.1 動物分組及處理 使用脫毛膏徹底清除小鼠背部毛發(fā)，再用溫水洗凈小鼠背部皮膚。16只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組和模型組，每組8只。銀屑病小鼠模型的構(gòu)建：小鼠背部皮膚均勻涂抹62.5 mg IMQ乳膏，輕輕按摩皮膚以促進(jìn)藥物吸收，每天給藥一次，連續(xù)6 d，第7 天造模完成[7]。對照組將IMQ乳膏換成凡士林，采用同樣的處理方法。小鼠于第7天取外周血，并處死取脾臟備用。

2.2 小鼠外周血免疫細(xì)胞的制備與處理 取EDTA抗凝的小鼠血400 μl，加入4 ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻。再次加入4 ml紅細(xì)胞裂解液重復(fù)以上操作后，將所得細(xì)胞重懸，經(jīng)40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾。取濾液于4 ℃下500×g離心5 min，棄去上清，將細(xì)胞重懸于 100 μl PBS中。依次加入流式抗體0.5 μl FITC-anti-mouse CD11C, 1.25 μl APC-anti-mouse B220, 0.5 μl PE-anti-mouse PD-L1或2 μl FITC-anti-mouse CD3, 1 μl APC-anti-mouse CD4, 2.5 μl PE-anti-mouse PD-1進(jìn)行混合染色。同型對照組中加入相應(yīng)的同型對照抗體用于流式檢測時的電壓調(diào)節(jié)。暗處放置30 min，加入PBS洗滌兩次后，用流式細(xì)胞儀檢測。

2.3 小鼠脾臟細(xì)胞的制備與處理 取小鼠新鮮脾臟，研磨過40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)，所得細(xì)胞中加入5倍體積的紅細(xì)胞裂解液。裂解2 min后，加入2倍體積的PBS稀釋，4 ℃下500×g離心5 min。棄去上清，將所得的細(xì)胞重懸于PBS中，通過40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾兩次，確保獲取單細(xì)胞懸液后進(jìn)行多色染色，染色方法同2.2項。細(xì)胞染色后，用流式細(xì)胞儀檢測蛋白質(zhì)表達(dá)。

3 結(jié) 果

3.1 IMQ誘導(dǎo)的銀屑病模型小鼠皮膚及脾臟變化 連續(xù)給藥6 d后，對照組小鼠皮膚光滑完整，未有異常變化。模型組小鼠背部皮膚出現(xiàn)明顯的鱗屑、紅斑、增生等銀屑病樣癥狀(見圖1 A)，表明造模成功。同時，模型組小鼠脾臟明顯變大(見圖1B)。

圖1 咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型的特點Figure 1 Characteristics of imiquimod-induced psoriasis-like mouse modelA：皮膚表征；B：脾臟形態(tài)

3.2 小鼠脾臟細(xì)胞中PD-1的表達(dá) 用平均熒光強度表示PD-1在小鼠脾臟細(xì)胞中總的表達(dá)量。結(jié)果模型組中PD-1的表達(dá)量較對照組高(見圖2A)。由于銀屑病是輔助性T細(xì)胞分泌IL-17A相關(guān)的炎癥性疾病，因此進(jìn)一步研究了CD3+CD4+輔助性T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟輔助性T細(xì)胞的比例下調(diào)，但其表達(dá)的PD-1卻顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖2B、2C。

圖2 用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟輔 助性T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)結(jié)果Figure 2 Dectection results of the expression of PD-1 in T helper cells in the spleen of mice by flow cytometryA：小鼠脾臟細(xì)胞中PD-1總的表達(dá)量(右上角的數(shù)值表示平均熒光強度)；B：脾臟中輔助性T細(xì)胞的百分比；C：脾臟輔助性T細(xì)胞中PD-1的百分比

3.3 小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞(DC)中PD-L1的表達(dá) 模型組小鼠脾臟中PD-L1的表達(dá)顯著高于正常組(P<0.01)，見表 1。由于銀屑病T細(xì)胞的活化有賴于DC，特別是漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)分泌的炎癥因子刺激，因此本研究還檢測了脾臟中DC及pDC細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)。結(jié)果表明，模型組小鼠不僅DC細(xì)胞及pDC細(xì)胞比例較對照組高(P<0.01)，且PD-L1的比例也上調(diào)，具體見表1。

表 1 小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)Table 1 Expression of PD-L1 in dendritic cells of the murine spleen

組別細(xì)胞含量DC(%)pDC(‰)PD-L1陽性比總的PD-L1(‰)DC中(%)pDC中(%)對照組4±12±111±215±318±6模型組14±1? ?6±1? ?74±4? ?45±2? ?52±7? ?

* *P<0.01，與對照組比較;PD-L1:程序性死亡配體1；DC:樹突狀細(xì)胞；pDC:漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞

3.4 小鼠外周血中PD-1的表達(dá) 模型組小鼠外周血總PD-1的表達(dá)量高于正常組(見圖 3A)，這與脾臟細(xì)胞測定結(jié)果一致。與脾臟細(xì)胞測定結(jié)果不同的是，模型組小鼠外周血中CD3+CD4+輔助性T細(xì)胞的比例及其表達(dá)的PD-1較對照組顯著下調(diào)(P<0.01)，具體見圖 3B、3C。

圖3 用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血中PD-1的表達(dá)結(jié)果Figure 3 Dectection results of the expression of PD-1 in murine peripheral blood by flow cytometryA：外周血細(xì)胞中PD-1總的表達(dá)量(右上角的數(shù)值表示平均熒光強度)；B：外周血中輔助性T細(xì)胞的百分比；C：外周血中輔助性T細(xì)胞中PD-1的百分比

3.5 小鼠外周血中PD-L1的表達(dá) 對照組小鼠外周血細(xì)胞中PD-L1陽性比為(9±1)%，較脾臟(11±2)‰顯著增加(P<0.01)。模型組小鼠外周血PD-L1表達(dá)較對照組增加，DC細(xì)胞比例上調(diào)，DC細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)增加(見表 2)，這與脾臟細(xì)胞的測定結(jié)果一致。不同的是， pDC細(xì)胞比例上調(diào)，但其表達(dá)的PD-L1卻降低了(P<0.01)。

4 討 論

PD-1在組織特異性的免疫疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，PD-1缺陷會引起小鼠發(fā)生自身免疫性疾病[8]。慢性炎癥性疾病中常見PD-1的高表達(dá)，阻斷PD-1后，炎癥反應(yīng)會擴大化，相反，當(dāng)使用其配體PD-L1后，會減輕疾病的炎癥程度[9]。PD-1的分布和數(shù)量可用來區(qū)分Sézary綜合征和紅皮病型炎癥性皮膚病，CD4+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)>50%，表明病人得的是Sézary綜合征[10]?？谇槐馄教μ\的角質(zhì)細(xì)胞中PD-L1上調(diào)，阻斷PD-L1后T細(xì)胞的增殖增加[11]。以上研究均表明，PD-1/PD-L1通路在慢性炎癥性疾病及自身免疫性疾病中有著重要的作用。

表 2 小鼠外周血樹突狀細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)Table 2 Expression of PD-L1 in dendritic cells in the peripheral blood of mice

組別細(xì)胞含量DC(%)pDC(‰)PD-L1陽性比總的PD-L1(%)DC中(%)pDC中(%)對照組5±114±19±147±261±1模型組23±2? ?16±2?26±1? ?87±1? ?47±1? ?

*P<0.05,**P<0.01，與對照組比較；PD-L1:程序性死亡配體1；DC:樹突狀細(xì)胞；pDC:漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞

銀屑病是免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病。PD-1/PD-L1通路在銀屑病中發(fā)揮保護(hù)性作用。腫瘤病人經(jīng)PD-1抗體nivolumab治療后可誘發(fā)銀屑病樣不良反應(yīng)[12]。扁桃體間充質(zhì)干細(xì)胞(tonsil-derived mesenchymal stem cells,T-MSCs)緩解小鼠銀屑病樣癥狀與PD-L1相關(guān)，加入PD-L1抗體后，T-MSCs的治療作用明顯減弱[13]。Kim等[4]通過免疫熒光的方法，發(fā)現(xiàn)在銀屑病病人皮損的真皮上部廣泛表達(dá)PD-1，而健康人皮膚上少見。皮損處，70%的T細(xì)胞表達(dá)PD-1，少量的自然殺傷細(xì)胞也表達(dá)PD-1。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，超過95%的IL-17A+T細(xì)胞表達(dá)PD-1，并且IL-17A+PD-1+T細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞和γδ+T細(xì)胞。該結(jié)果表明，靶向PD-1可抑制IL-17A+PD-1+T細(xì)胞，用于治療銀屑病的炎癥反應(yīng)[4]。

本研究通過流式細(xì)胞術(shù)，檢測IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠和正常小鼠脾臟、血液中PD-L1、PD-1的表達(dá)，進(jìn)一步探討PD-1/PD-L1通路在銀屑病中的作用。結(jié)果表明，相對正常小鼠，IMQ誘導(dǎo)的小鼠無論是脾臟還是血液中PD-L1及PD-1的表達(dá)都增加。這可能因為T細(xì)胞在接受連續(xù)或重復(fù)性的刺激后，其PD-1的表達(dá)增加[9]。而銀屑病相關(guān)的T細(xì)胞，尤其是輔助性T細(xì)胞在脾臟與血液中PD-1的表達(dá)完全相反。銀屑病小鼠血液中輔助性T細(xì)胞表達(dá)的PD-1下調(diào)，使PD-L1與PD-1結(jié)合變少，輔助性T細(xì)胞失活減少，分泌IL-17A增多，從而引起一系列炎癥反應(yīng)。同時，在總PD-L1上調(diào)的趨勢下，血液中pDC細(xì)胞表達(dá)的PD-L1下調(diào)，可能對疾病也有影響，因為pDC可通過PD-L1抑制CD4+T細(xì)胞的活力[14]。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)銀屑病小鼠外周血pDC細(xì)胞中PD-L1表達(dá)下調(diào)和輔助性T細(xì)胞中PD-1下調(diào)在銀屑病發(fā)生過程中可能起重要作用。兩者的下調(diào)影響了PD-1/PD-L1通路在銀屑病中的正常功能。結(jié)合銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞PD-L1表達(dá)下調(diào)，重組PD-L1蛋白可緩解銀屑病小鼠的炎癥癥狀，提示可以從糾正角質(zhì)形成細(xì)胞、血液pDC細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，及輔助性T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)出發(fā)，選擇合適的PD-1通路藥物治療銀屑病。