楊 楠，范國榮

[1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433；2.海軍青島特勤療養(yǎng)中心藥劑科，山東青島 266072；3.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，上海 200092；4.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200080]

胃癌是全球致死率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人類健康[1]。臨床數(shù)據(jù)顯示，對早期胃癌病人進(jìn)行手術(shù)治療，其5年存活率>85%，而在進(jìn)展期手術(shù)5年生存率僅約40%[2]。因此，采取有效檢測手段進(jìn)行早期診斷對胃癌的治療尤為重要。研究表明，癌細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的迅速增殖、轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散都與癌細(xì)胞膜上的糖鏈形成有關(guān)[3,4]。在特定的狀態(tài)下，糖蛋白量的變化和/或其糖鏈結(jié)構(gòu)的改變，能夠體現(xiàn)特定的生理、病理過程[5,6]。迄今為止，已經(jīng)有多種癌癥被證實(shí)與糖基化的異常變化有關(guān)，例如肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌等[7,8]。因此應(yīng)用糖組學(xué)技術(shù)分析癌癥病人糖基化的變化對于深入研究腫瘤發(fā)生機(jī)制以及臨床早期診斷至關(guān)重要[9]。Lebrilla教授的課題組基于UPLC-QqQ-MS/MS技術(shù)建立了定量測定人血清中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM，以及所含N-糖肽的方法[10,11]，采用nano-LC-Chip-QTOF對人血清中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM，標(biāo)準(zhǔn)品中胰蛋白酶酶解后的肽段和糖肽進(jìn)行定性分析，從而確定IgG、IgA和IgM中能夠用來定量的肽段。選擇用于絕對定量的肽段需要具備以下條件：(1)唯一性，用來進(jìn)行定量研究的肽段不能出現(xiàn)在血清的其他蛋白質(zhì)中；(2)避免選擇包含翻譯后修飾的多肽，例如磷酸化和甲基化的多肽，以減少樣品間的差異；(3)避免選擇包含經(jīng)過了去氨基或者氧化后的氨基酸，因?yàn)檫@些變化一般不完全，并且會(huì)在樣品處理中發(fā)生變化。借鑒上述研究，本研究僅選擇了具有高重復(fù)性的多肽用于定量，采用UPLC-QqQ-MS/MS法對胃癌與胃炎病人血清中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM，以及所含N-糖肽進(jìn)行定量測定，通過統(tǒng)計(jì)分析，試圖找到兩者之間具有顯著性差異的N-糖肽分子標(biāo)志物，為胃癌診斷提供參考。

1 材 料

1.1 儀器 1290 Infinity 超高效液相色譜儀、串聯(lián)6490三重四級桿質(zhì)譜儀、Agilent Eclipse plus C18色譜柱(美國Agilent公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國Eppendorf公司)；恒溫培養(yǎng)箱、渦旋混合器(美國Thermo Scientific公司)；恒溫水浴鍋(美國PolyScience公司)；微量電子天平(美國Mettler Toledo公司)。

1.2 試劑和藥品 人免疫球蛋白IgG標(biāo)準(zhǔn)品、人免疫球蛋白IgM標(biāo)準(zhǔn)品、人混合血清標(biāo)準(zhǔn)品、碘代乙酰胺(IAM)、碳酸氫銨、Sigma血清(美國Sigma-Aldrich公司)；人免疫球蛋白IgA標(biāo)準(zhǔn)品(美國Cal Biochem公司)；二硫蘇糖醇(DTT)、胰蛋白酶(美國Madison公司)；乙腈(色譜純，美國Honeywell公司)；甲酸(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；去離子水為實(shí)驗(yàn)室用Mili-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)自制。

1.3 生物樣品 所有血清樣品均來自墨西哥城綜合醫(yī)院胃腸病科，對血清樣品的使用已獲病人的知情同意，該研究在美國加州大學(xué)戴維斯分校分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 墨西哥城綜合醫(yī)院胃腸病科先后提供了兩批胃癌與胃炎病人混合樣品，第一批樣品共138個(gè)，其中胃癌血清樣品92個(gè)，胃炎血清樣品46個(gè)，作為第一組；另外一批樣品共38個(gè)，其中胃癌血清樣品12個(gè)，胃炎血清樣品26個(gè)，作為第二組?；诮⒌拿庖咔虻鞍准癗-糖肽測定方法，同時(shí)處理并測定兩組血清中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的蛋白質(zhì)與N-糖肽，通過JMP Pro 11統(tǒng)計(jì)軟件對第一組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，找到胃炎與胃癌病人血清中有顯著性差異的蛋白質(zhì)與N-糖肽，作為潛在的胃癌生物標(biāo)志物。將這些潛在的生物標(biāo)志物應(yīng)用于第二組，通過R Language軟件進(jìn)行最小二乘法(partial least squares,PLS)分析，觀察潛在的分子標(biāo)志物對胃炎與胃癌病人的分離情況。

2.2 樣品前處理

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品前處理 分別吸取20 μl IgG、IgA、IgM標(biāo)準(zhǔn)溶液(即100 μg IgG、20 μg IgA和20 μg IgM)，加入50 mmol/L新鮮配制的碳酸氫銨緩沖液18 μl，然后加入4 μl的550 mmol/L的DTT溶液，使蛋白質(zhì)中二硫鍵斷裂。60 ℃水浴中反應(yīng)50 min；再加入8 μl的450 mmol/L的IAM溶液，室溫下避光反應(yīng)30 min，使斷裂后的巰基甲基化，防止二硫鍵形成。將20 μg胰蛋白酶溶于200 μl新鮮配制的50 mmol/L碳酸氫銨緩沖液中，搖勻，取20 μl加入蛋白溶液中進(jìn)行酶解，在37 ℃保溫箱中反應(yīng)18 h，然后將標(biāo)準(zhǔn)品置于-20 ℃冰箱中放置1 h，結(jié)束酶解反應(yīng)，配置成濃度為0.009、0.018、0.09、0.18、0.45、0.9 μg/ml的IgG系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，濃度為0.001 8、0.003 6、0.018、0.036、0.09、0.18 μg/ml的IgA系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，以及與IgA相同濃度的IgM系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，用于進(jìn)樣分析。

2.2.2 實(shí)測樣品前處理 吸取2 μl血清樣品置96孔板中，每10個(gè)樣品穿插一個(gè)Sigma血清。向血清樣品中添加92 μl的50 mmol/L碳酸氫銨緩沖液，然后加入2 μl的550 mmol/L DTT，渦旋1 min，60 ℃水浴中反應(yīng)50 min。向樣品中加入4 μl的450 mmol/L IAM，渦旋1 min(速度7檔)，室溫條件下避光放置30 min，調(diào)節(jié)pH至7.5。向20 μg的胰蛋白酶中加入200 μl的50 mmol/L碳酸氫銨緩沖液，向每個(gè)血清樣品中加入10 μl的0.1 μg/μl胰蛋白酶，置37 ℃干燥的恒溫箱中反應(yīng)18 h。以相對離心力4.472×102×g離心1 min，然后置-20 ℃冰箱 1 h停止反應(yīng)，用于進(jìn)樣分析。

2.3 N-糖肽生物分子標(biāo)志物的定性和定量檢測

2.3.1 液相色譜條件 Agilent Eclipse plus C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，柱溫35 ℃，流速0.5 ml/min，分析時(shí)間10 min，進(jìn)樣量1 μl。流動(dòng)相組成為A相：乙腈∶甲酸∶水=3∶0.1∶97(V/V/V)，B相：乙腈∶甲酸∶水=90∶0.1∶10(V/V/V)，采用梯度洗脫。血清中IgG和N-糖肽定量洗脫梯度設(shè)置如下：0～2.5 min 2%～5%B，2.5～7.0 min 5%～40%B，7.0～7.1 min 40%～100%B，7.1～8.6 min 100%B，8.6～8.7 min 100%～2%B，8.7～10.0 min 2%B。血清中IgA與IgM及N-糖肽定量洗脫梯度設(shè)置如下：0～0.5 min 2%B，0.5～4.0 min 2%～15%B，4.0～8.0 min 15%～44%B，8.0～8.1 min 44%～100%B，8.1～9.5 min 100%B，9.5～9.6 min 100%～2%B，9.6～10.0 min 2%B。

2.3.2 質(zhì)譜條件 正離子模式；霧化氣溫度：290 ℃；氮?dú)饬髁浚?1 L/min；氮?dú)鈮毫Γ?06.85 kPa(30 Psi)；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細(xì)管電壓：1800 V；電噴霧電壓：1500 V。

2.3.3 IgG、IgA與IgM蛋白質(zhì)定量監(jiān)測通道 對IgG進(jìn)行蛋白質(zhì)定量時(shí)，選擇DTLMISR肽段建立多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方法，其母離子為[M+2H]2+(m/z418.3)，m/z506.3與m/z619.4作為定量反應(yīng)的子離子。對IgG四個(gè)亞型在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律進(jìn)行分析，確定IgG亞型的MRM定量方法的離子通道如下。IgG1：[M+2H]2+m/z839.4→m/z968.5與m/z1 067.6；IgG2：[M+3H]3+m/z970.1→m/z1 100.6與m/z839.5；IgG3：[M+3H]3+m/z472.9→m/z697.4與m/z534.3；IgG4：[M+3H]3+m/z635.0→m/z1 217.6與m/z425.2。所有IgG肽段的MRM裂解離子通道、保留時(shí)間和裂解電壓見表1。對IgA進(jìn)行蛋白質(zhì)定量時(shí)，離子通道為[M+2H]2+m/z448.7→m/z620.3和[M+2H]2+m/z607.4→m/z914.5。經(jīng)過對IgA兩個(gè)亞型在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律進(jìn)行分析，確定IgA亞型的MRM定量方法的離子通道如下。IgA1：[M+2H]2+m/z466.3→m/z415.8與[M+2H]2+770.9→m/z475.3。IgA2：[M+3H]3+m/z756.9→m/z475.3。對IgM進(jìn)行蛋白質(zhì)定量時(shí)，離子通道為[M+2H]2+m/z639.4→m/z331.2與[M+2H]2+m/z573.0→m/z734.9，J chain蛋白質(zhì)定量的離子通道為[M+2H]2+m/z695.3→m/z971.5與[M+2H]2+m/z469.8→m/z613.3。所有IgA和IgM肽段的MRM裂解離子通道、保留時(shí)間和裂解電壓見表2。

2.3.4 IgG、IgA與IgM糖肽定量監(jiān)測通道 由于糖肽的碎片離子中都包含m/z204.08 和m/z366.14，因此從中選擇響應(yīng)更高的離子作為糖蛋白的子離子。在IgG的四種亞型中，IgG3和IgG4連接N-糖鏈的肽段是由相同的氨基酸組成(IgG3：EEQYNSTFR，IgG4：EEQFNSTRY)，相對分子質(zhì)量相同，因此IgG3和IgG4上的糖肽區(qū)分不開，而IgG1和IgG2連接N-糖鏈的肽段氨基酸組成不同(IgG1：EEQYNSTYR，IgG2：EEQFNSTFR)， 因此可以對IgG1和IgG2上的糖肽分別進(jìn)行定量。在液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析中，IgA與IgM中的理論N-糖基化位點(diǎn)并未完全被N-糖基化；在IgA1中，N-糖基化現(xiàn)象僅在N144上發(fā)現(xiàn)，其定量肽段為LSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLR；IgA2的N-糖鏈位于N131與N205上，其定量肽段分別為LSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLR和TPLTANITK。由以上分析結(jié)果可知，IgA1上的N144與IgA2上的N131糖肽一致，區(qū)分不開，因此對該糖肽進(jìn)行定量分析時(shí)，需要首先對IgA進(jìn)行歸一化，再進(jìn)行定量比較。IgM的N-糖基化出現(xiàn)在N46、N209和N439上，定量糖肽分別為YKNNSDISSTR、GLTFQQNASSMCVPDQDTAIR和STGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY；J鏈的N71糖基化位點(diǎn)位于肽段ENISDPTSPLR上。

表1 IgG蛋白質(zhì)及糖肽多反應(yīng)監(jiān)測離子通道Table 1 MRM transitions for quantitative analysis of IgG and its N-glycopeptides

表2 IgA和IgM蛋白質(zhì)及糖肽多反應(yīng)監(jiān)測離子通道Table 2 MRM transitions for quantitative analysis of IgA,IgM and N-glycopeptides

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Agilent MassHunter Quantitative Analysis B.6.0軟件對MRM采集數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，將計(jì)算所得數(shù)據(jù)用JMP Pro 11和R Language軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Agilent應(yīng)用軟件計(jì)算結(jié)果時(shí)，需要對進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的N-糖肽進(jìn)行篩選，若一種N-糖肽測得的色譜圖<總量的70%，則不對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用JMP Pro 11軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05表示具有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 IgG、IgA與IgM蛋白質(zhì)測定的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線 通過UPLC-QqQ-MS/MS對IgG、IgA與IgM不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液進(jìn)行定量測定，以峰面積(A)對相應(yīng)濃度(c)進(jìn)行1/X加權(quán)，再做線性回歸。得到IgG的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=5.599×105c+9.023×103(r=0.995 1)，IgA隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=6.030×105c-2.084×103(r=0.996 9)，IgM隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=7.278×105c-3.657×103(r=0.998 4)。3種免疫球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

3.2 定量測定重現(xiàn)性考察 本研究采用的前處理方法重現(xiàn)性良好，RSD<15%(n=21)。對于樣品測定過程中儀器穩(wěn)定性的考察，響應(yīng)信號(hào)重現(xiàn)性良好，RSD<13%(n=20)。

3.3 胃癌潛在生物標(biāo)志物研究 采用JMP Pro 11軟件對第一組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，試圖找到胃癌組與胃炎組之間具有顯著性差異的N-糖肽。通過對IgG中5種蛋白質(zhì)和27種N-糖肽進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，找到3個(gè)具有顯著性差異的N-糖肽，這3種N-糖肽都位于IgG1亞型上，而胃癌病人與胃炎病人血清中IgG及4種亞型的含量并無顯著性差異。通過對IgA中3種蛋白質(zhì)和17種N-糖肽進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，也找到3個(gè)具有顯著性差異的N-糖肽，這3種N-糖肽都位于N144-IgA1/N131-IgA2亞型，而胃癌病人與胃炎病人血清中IgA及兩種亞型的含量并無顯著性差異。通過對IgM及其J鏈中2種蛋白質(zhì)及17種N-糖肽進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)具有顯著性差異的N-糖肽，這種N-糖肽位于N46-IgM上，胃癌病人與胃炎病人血清中IgM及其J鏈含量并無顯著性差異。

在IgG1中N4400、N5400和N4410具有顯著性差異，且胃癌病人血清中這3種N-糖肽的含量較胃炎病人明顯降低。在IgA中具有顯著性差異的N-糖肽N3500、N5400和N5402含量均為胃癌病人體內(nèi)較低，這3種N-糖肽并沒有明顯的分類規(guī)律，其中IgG和IgA中的N5400在胃癌和胃炎病人中的含量均表現(xiàn)出顯著性差異；在IgM及其J鏈中，只有N5501的含量在胃癌病人和胃炎病人之間表現(xiàn)出顯著性差異，在胃癌病人體內(nèi)含量降低。根據(jù)上述分析結(jié)果，得出以下結(jié)論：IgG、IgA和IgM蛋白質(zhì)定量測定在胃癌病人和胃炎病人血清中并無發(fā)生顯著性變化，而N-糖肽的含量卻在疾病變化過程中發(fā)生顯著性變化，并且變化趨勢一致，即在胃癌病人中普遍呈現(xiàn)降低趨勢。對于N-糖肽的糖鏈結(jié)構(gòu)而言，并沒有表現(xiàn)出非常明顯的類別規(guī)律，但是可以看出，含量具有顯著性差異的N-糖肽在糖鏈結(jié)構(gòu)上都含有至少4個(gè)N-乙酰葡萄胺(GlcNAc)。由此推斷，隨著胃癌的發(fā)生與發(fā)展，胃癌病人體內(nèi)GlcNAc酶的合成或活性受到了抑制。

3.4 胃癌潛在生物標(biāo)志物驗(yàn)證 進(jìn)一步將第一組研究中發(fā)現(xiàn)的潛在胃癌N-糖肽標(biāo)志物應(yīng)用于第二組血清樣本的分析，采用R Language軟件中的PLS法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，考察本方法中發(fā)現(xiàn)的潛在N-糖肽標(biāo)志物是否能夠?qū)⑽赴┙M與胃炎組分離。在分析過程中，將潛在的N-糖肽生物標(biāo)志物按歸屬分為以下6組， PLS統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見圖1。 圖1中藍(lán)色代表胃炎組，紅色代表胃癌組，數(shù)字為血清編號(hào)。由圖1可見，僅采用IgG1或IgA上的潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行PLS分析，胃癌病人與胃炎病人并沒有顯示出較好的分離趨勢(見圖1A、B)；同樣，將IgM中的糖肽生物標(biāo)志物與IgG1或IgA聯(lián)用進(jìn)行PLS分析也沒有得到良好分離趨勢(見圖1C、D)；而將IgG1與IgA上潛在的生物標(biāo)志物聯(lián)用，或者IgG1、IgA與IgM上潛在的生物標(biāo)志物聯(lián)用進(jìn)行PLS分析，則可以發(fā)現(xiàn)胃癌病人與胃炎病人已經(jīng)出現(xiàn)了分離的趨勢(見圖1E、F)。

圖1 胃癌和胃炎病人血清中N-糖肽生物標(biāo)志物區(qū)分情況的最小二乘法統(tǒng)計(jì)分析圖Figure 1 Partial least square analysis of the differentiation of N-glycopeptide >biomolecular markers in serum of patients with gastric cancer and gastritisA：N4400-IgG1、N5400-IgG1和N4410-IgG1；B：N3500-IgA、N5400-IgA和N5402-IgA；C：N4400-IgG1、N5400-IgG1、N4410-IgG1和N5501-J；D：N3500-IgA、N5400-IgA、N5402-IgA和N5501-J；E：N4400-IgG1、N5400-IgG1、N4410-IgG1、N3500-IgA、N5400-IgA和N5402-IgA；F：N4400-IgG1、N5400-IgG1、N4410-IgG1、N3500-IgA、N5400-IgA，N5402-IgA和N5501-J；○：胃癌；●：胃炎

綜上所述，本研究通過對胃癌與胃炎病人血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM蛋白質(zhì)及N-糖肽進(jìn)行定量分析，尋找胃癌病人血清中潛在的生物標(biāo)志物。研究結(jié)果表明，胃癌病人與胃炎病人血清免疫球蛋白中的確可以找到具有顯著性差異的N-糖肽N4400-IgG1、N5400-IgG1、N4410-IgG1、N3500-IgA、N5400-IgA、N5402-IgA和N5501-J，這些糖肽含量在胃癌病人體內(nèi)較低，所有具有顯著性差異的N-糖肽在糖鏈結(jié)構(gòu)上都含有至少4個(gè)GlcNAc。由此可以初步推斷，隨著胃癌的發(fā)生與發(fā)展，胃癌病人體內(nèi)GlcNAc酶的合成或活性受到了抑制。進(jìn)一步運(yùn)用潛在的N-糖肽對病人血清樣品進(jìn)行分析，可以看出，采用以上N-糖肽對胃癌病人與胃炎病人血清進(jìn)行PLS統(tǒng)計(jì)分析，雖然沒有完全分離，但是表現(xiàn)出一定的分離趨勢。該方法為臨床疾病生物分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了有力的支持，且可能對胃癌的早期診斷具有一定的臨床意義。