莊倩楠, 韓 特, 吳超男, 王曉丹, 郝吉福

(泰山醫(yī)學院藥學院藥劑學教研室，山東泰安271016)

冬凌草甲素(oridonin)是由唇形科香茶菜屬植物中提取分離得到的，以貝殼杉烯為骨架的四環(huán)二萜類化合物[1]?，F(xiàn)代研究表明，冬凌草甲素具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗炎和抗菌等[2]。但冬凌草甲素水溶性差、生物半衰期短的缺點限制了其在臨床的應用；因此，如何提高其生物利用度成為亟待解決的問題。納米遞藥系統(tǒng)近年來成為人們關注的熱點，尤其是在改善難溶性藥物的水溶性、提高生物利用度方面發(fā)揮著重要作用[3]。聚乳酸(PLA)-羥基乙酸(PGA)共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]作為一種被FDA批準的高分子材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性與操作可控性，已廣泛用作制備納米粒的載體材料[4]。本研究以冬凌草甲素為模型藥物，以PLGA為載體材料制備荷載冬凌草甲素的PLGA納米粒，并對其理化性質、體內藥動學特征進行研究，以期為該藥物的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材 料

1.1 儀器 JY92-Ⅱ探頭超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；超速冷凍離心機(日本日立公司)；Mastersizer 3000 粒度分析儀(英國馬爾文公司)；VP-10A plus高效液色譜儀(日本島津公司)；XW-80A微型漩渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠)；FDU-1200臺式冷凍干燥機(日本東京理化株式會社)；DCY-24Y圓形水浴氮吹儀(南京肯凡電子科技有限公司)；JEM-1200EX透射電鏡(日本電子株式會社)。

1.2 藥品和試劑 冬凌草甲素(純度98%，批號20150709，西安昊軒生物科技有限公司)；冬凌草甲素對照品(純度99.7%，批號111721-201704，中國食品藥品檢定研究院)；PLGA(PLA∶PGA=50∶50, 相對分子質量為55 000，批號20160312，濟南岱罡生物材料有限公司)；聚乙烯醇(PVA，美國Sigma Aldrich公司)；其余試劑均為色譜純或分析純。

1.3 動物 雄性SD大鼠，體質量(230±20) g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物合格證號SCXY(魯)20140007。

2 方法和結果

2.1 冬凌草甲素PLGA納米粒的制備 采用乳化超聲-溶劑揮發(fā)法制備荷載冬凌草甲素的PLGA納米顆粒[5]。精確稱取10 mg冬凌草甲素，100 mg PLGA，共同溶于4.5 ml乙酸乙酯中作為油相，以0.25%的PVA水溶液20 ml作為水相，在磁力攪拌下將油相加入到水相中，置探頭式超聲粉碎儀超聲3 min(超聲功率400 W)，形成外觀均一的乳劑。旋轉蒸發(fā)以除去殘留的有機溶劑，所得到的納米混懸劑以1.002×104×g超速離心15 min，棄去含有游離藥物的上清液，沉淀用蒸餾水分散，洗滌兩次，收集沉淀，加入3%甘露醇作為凍干保護劑進行冷凍干燥，得冬凌草甲素PLGA納米粒,備用。同法制備不含冬凌草甲素的PLGA空白納米粒。

2.2 理化性質的表征 取將制備的冬凌草甲素PLGA納米粒凍干加入適量蒸餾水分散，稀釋，用激光粒度分析儀測定其粒徑分布。將冬凌草甲素PLGA納米粒稀釋后滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上制樣，以2%磷鎢鉬酸進行負染，透射電鏡觀察其粒徑形態(tài)。結果表明所制備的冬凌草甲素PLGA納米粒平均粒徑為180 nm，多分散指數(shù)(PDI)為0.103，外觀呈規(guī)則球狀，無粘連。粒徑分布及透射電鏡結果見圖1。

圖1 冬凌草甲素PLGA納米粒粒徑分布及透射電鏡圖Figure 1 Particle size distribution and transmission electron microscopy of oridonin PLGA nanoparticlesA：粒徑分布圖；B：透射電鏡圖；PLGA：聚乳糖-羥基乙酸

2.3 包封率及載藥量的測定

2.3.1 冬凌草甲素含量測定色譜條件 色譜柱：Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，預柱(4 mm×4 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(60∶40)；檢測波長：238 nm；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2.3.2 標準曲線的制備 精密稱取冬凌草甲素對照品9.8 mg至10 ml容量瓶，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為儲備液。分別精密量取冬凌草甲素對照品儲備液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 ml置10 ml容量瓶中，以流動相稀釋并定容至刻度，進樣測定。以峰面積(A)為縱坐標，濃度(c)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為：A=10 621c-2 736(r=0.999 8)，結果表明冬凌草甲素在9.8～490 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.3.3 含量測定方法學考察 精密稱取空白納米粒凍干品適量, 加氯仿超聲溶解, 1×104×g離心15 min后分取上清液，定量加入冬凌草甲素對照品儲備液適量，配制濃度分別為0.05、0.25 和0.45 mg/ml的溶液各5份，置氮吹儀中揮干溶劑，殘渣用流動相溶解并稀釋至濃度為0.05、0.25 和0.45 mg/ml，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，取濾液20 μl進樣測定，評價測定方法的精密度、穩(wěn)定性及回收率。結果低、中、高3個濃度下測得的精密度分別為97.6%、99.3%和98.5%，RSD 分別為2.36%、1.57%和2.64%(n=5)。穩(wěn)定性實驗結果表明冬凌草甲素在12 h內穩(wěn)定，RSD均<3%(n=5)?？瞻谆厥章史謩e為97.1%、98.2%和97.9%，RSD分別為3.18%、1.90%和2.30%(n=5)。

2.3.4 包封率及載藥量的測定 精密稱取冬凌草甲素PLGA納米粒凍干粉適量，加入氯仿后超聲溶解，將得到的溶液置于氮吹儀中除去溶劑，殘渣用流動相溶解并稀釋至一定濃度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后按2.3.1項下色譜條件進樣測定并記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算得到的冬凌草甲素含量作為包載于PLGA納米粒內的藥量(m包載)，根據(jù)投藥量(m總量)及所用PLGA的重量(mPLGA)，分別按下列公式計算包封率(entrapment efficiency，EE)與載藥量(drug loading,DL)。EE(%)=(m包載/m總量)×100%，DL(%)=[m包載/(m總量+mPLGA)]×100%。結果表明，冬凌草甲素的包封率及載藥量分別為(87.7±7.7)%及(7.5±0.8)%(n=3)。

2.4 大鼠體內藥動學評價

2.4.1 血漿樣品處理方法 精密吸取血漿樣品100 μl，置1.5 ml離心管中，精密加入乙腈300 μl，渦旋3 min混合均勻，超高速離心機1.002×104×g離心10 min，取上清液20 μl進樣分析。

2.4.2 血漿樣品中冬凌草甲素含量測定方法

2.4.2.1 色譜條件 同2.3.1項下色譜條件。

2.4.2.2 方法專屬性考察 分別取受試大鼠的空白及含藥血漿100 μl，按2.4.1項下方法處理血漿樣品，進樣20 μl測得空白及含藥血漿的色譜圖。結果表明，血漿中的內源性物質不干擾冬凌草甲素的測定，冬凌草甲素色譜峰的保留時間約為6.2 min，結果見圖2。

圖2 冬凌草甲素的HPLC譜圖Figure 2 HPLC chromatograms of oridoninA:空白血漿;B:含藥血漿

2.4.2.3 血漿樣品測定的方法學考察 精密稱取冬凌草甲素對照品5.11 mg 置10 ml 容量瓶中，加適量甲醇使其充分溶解并定容至刻度，得511 μg/ml的標準儲備液，再稀釋成梯度濃度分別為0.303、6.06、12.12、24.24、30.3 μg/ml的對照品溶液備用。取空白血漿50 μl共5份，加入上述系列濃度的冬凌草甲素對照品溶液100 μl，制備成含藥血漿對照品溶液，按2.4.1項下方法處理后進樣分析，得回歸方程為:A=11 012c+4 083(r=0.999 8)。結果表明冬凌草甲素在0.202～20.2 μg/ml范圍內線性關系良好。精密度、穩(wěn)定性及加樣回收率實驗測得的RSD均<10%，能滿足生物樣品的測定要求。

2.4.3 大鼠體內藥動學實驗 取SD大鼠5只，實驗前禁食12 h 以上，自由飲水。尾靜脈注射2.1項下制備的冬凌草甲素PLGA納米?；鞈乙?.6 ml， 給藥劑量為4 mg/kg，分別于給藥后0.5、1、2、3、4、8、10、24 h眼內眥取血約0.2 ml，置于肝素化離心管中，2.8×103×g離心10 min。分取血漿，按2.4.1項下方法處理，繪制血藥濃度-時間曲線，結果見圖3。

圖3 大鼠尾靜脈注射冬凌草甲素PLGA納米粒后的平均血藥濃度-時間曲線Figure 3 The mean plasma concentration-time curve oforidonin after intravenous administration of oridonin PLGA nanoparticles through caudal vein in ratsPLGA：聚乳糖-羥基乙酸；

將所得到的平均血藥濃度-時間數(shù)據(jù)用DAS(Drug and Statistics)軟件進行房室模型擬合，并計算藥動學參數(shù)。以擬合優(yōu)度值、Akaike’s information criterion(AIC)確定合適的模型。結果表明，大鼠尾靜脈注射冬凌草甲素PLGA納米粒后，其體內過程符合二室模型。主要的藥動學參數(shù)如下：分布半衰期(t1/2α)為2.115 h，消除半衰期(t1/2β)為69.315 h，血藥濃度曲線下面積(AUC)為42.463 mg·h·L-1，清除率(CL)為0.094 L·h-1·kg-1，表觀分布容積(V)為0.4 L/kg。

3 討 論

冬凌草甲素的結構特點決定了其難溶于水。為改善冬凌草甲素的水溶性并提高生物利用度，近年來有關其制劑的研究包括制備成包合物、長循環(huán)脂質體、固態(tài)脂質納米粒等劑型。在本研究中，結合冬凌草甲素易溶于氯仿、乙酸乙酯等有機溶劑的性質，利用生物可降解材料PLGA為載體材料，將冬凌草甲素及PLGA共同溶解在乙酸乙酯中作為油相，加入到含有穩(wěn)定劑PVA的水溶液中，通過超聲分散，能夠形成包含藥物及PLGA載體材料的小油滴，通過溶劑揮發(fā)，可以降低PLGA與冬凌草甲素的溶解度，以骨架型結構共同析出形成納米粒。在制備PLGA納米粒的前期工作中發(fā)現(xiàn)，PLGA納米粒的理化性質與PLGA的規(guī)格、藥物與PLGA的比例、穩(wěn)定劑PVA的濃度、超聲時間與超聲功率等有關系。PLGA的分子量越大，越易形成納米粒，但分子量越大，其降解速度越慢，如考慮發(fā)揮長效緩釋作用可以選擇分子量較大的PLGA。當處方中PLGA的比例較高時，可以增加對藥物的包封率，但相應地會影響載藥量。而PVA除了作為乳化劑降低油水兩相之間的表面張力，有利于形成乳劑之外，還可以分散在油滴之間，阻礙油滴與油滴之間的聚集，防止在溶解揮發(fā)過程中油滴相互合并而增大粒徑。同時，在制備過程中超聲功率越大、超聲時間越長，能夠為體系的乳化環(huán)節(jié)提供更大的機械能，可以使油滴分散得更細膩、更均勻，有利于減少納米粒的粒徑[6]。

大鼠體內藥動學結果經(jīng)DAS藥動學軟件分析，分別按照一室、二室及三室模型進行擬合，其中二室模型的AIC 值最小，提示在該實驗條件下， 靜脈注射冬凌草甲素PLGA納米粒的藥動學模型符合二房室模型，權重為1/C2時擬合最好。其中冬凌草甲素的分布半衰期、消除半衰期分別為2.115和69.315 h，表明以消除過程為主，同時消除半衰期接近70 h，體現(xiàn)出冬凌草甲素PLGA納米粒在體內具有較好的緩釋特點。在以后的工作中需要進一步比較和評價冬凌草甲素PLGA納米粒與普通冬凌草甲素制劑的特點及其抗腫瘤作用。