徐 飛，覃麗鳳，黃巧婷，曹建民，王 平，徐玉明*

前言

高原低氧會(huì)降低肌肉工作能力、改變肌纖維（肌細(xì)胞）的形態(tài)和代謝功能，最終導(dǎo)致骨骼肌萎縮（Martin et al.，2017）。而大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)造成肌纖維微損傷和延遲性肌肉酸痛是運(yùn)動(dòng)性肌損傷（exercise-induced muscle damage，EIMD）的主要癥狀。但因低氧影響肌肉代謝和肌纖維損傷（Luo et al.，2016；Rovida et al.，2015）的機(jī)制不明確，所以低氧下提高肌肉工作能力的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑和訓(xùn)練方法的應(yīng)用受限。有研究發(fā)現(xiàn)，離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌損傷與鈣激活中性蛋白酶—泛素（calpain-ubiguitin）結(jié)合途徑有關(guān)（金其貫 等，2010，2011）。calpain是一種蛋白降解酶，其被激活后會(huì)降解肌肉的各種蛋白，所以calpain在離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肌纖維損傷過程中的作用備受關(guān)注。Lomonosova等（2014）觀察到，當(dāng)肌纖維損傷程度降低時(shí)calpain活性也降低，提示calpain與肌損傷有關(guān)。已證實(shí)大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)和低氧導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載是激活calpain的關(guān)鍵。隨著研究推進(jìn)，證實(shí)肌細(xì)胞內(nèi)微摩爾（μ mol）和毫摩爾（m mol）級(jí)的Ca2+濃度便可激活calpain家族的calpain1（μ-calpain）、calpain2（m-calpain）（Bartoli et al.，2005）。骨骼肌和心肌特異性高表達(dá)的calpain3，也成為關(guān)注焦點(diǎn)（Murphy et al.，2006，2009，2011）。

細(xì)胞膜被破壞是細(xì)胞不可逆性損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，膜骨架蛋白丟失是膜損傷的重要機(jī)制（王金發(fā)，2003）?？辜∥s蛋白dystrophin（Freitas et al.，2016）、utrophin（Guiraud et al.，2017）是肌細(xì)胞主要的肌節(jié)外骨架蛋白，dysferlin高表達(dá)于骨骼肌，并參與肌細(xì)胞膜融合修復(fù)（Bansal et al.，2003；Cardenas et al.，2016），3種骨架蛋白對(duì)維持肌細(xì)胞和肌細(xì)胞膜的形態(tài)和功能具有重要作用。已證實(shí)，肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（limb-girdle muscular dystrophy，LGMD）主要與肌膜蛋白和近膜蛋白缺陷有關(guān)，其中dystrophin是關(guān)鍵蛋白（Guiraud et al.，2017），也發(fā)現(xiàn)LGMD-2A和2B型的缺陷蛋白分別為calpain3和dysferlin（Roudaut et al.，2013）。上述證據(jù)鏈提示：低氧和離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的Ca2+超載－激活calpain－calpain激活后降解細(xì)胞膜骨架蛋白－膜骨架蛋白丟失－影響細(xì)胞膜形態(tài)和功能。因此，探索calpain在低氧對(duì)EIMD后肌細(xì)胞膜損傷中的作用和調(diào)控機(jī)制，對(duì)醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域的研究有重要參考價(jià)值。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

110只SPF級(jí)8周 齡 雄 性SD健 康 大 鼠（體 重196.6±10.1 g，購(gòu)自北京維通利華公司）在22±2℃、30%～60%相對(duì)濕度環(huán)境下，以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料分籠飼養(yǎng)，12/12 h光照/熄燈晝夜交替，自由飲食。適應(yīng)環(huán)境3天后分批完成低氧觀察實(shí)驗(yàn)（研究I，圖1B）和抑制劑實(shí)驗(yàn)（研究II，圖1C）①各組如有大鼠脫落，用備用大鼠補(bǔ)齊樣本。。研究I（低氧對(duì)EIMD后膜損傷、calpain和膜骨架蛋白的影響）：70只大鼠隨機(jī)分為7組（每組n＝10），包括安靜對(duì)照組（C組）、常氧24 h、48 h和72 h組（N24、N48和N72組）以及低氧24 h、48 h和72h組（H24、H48和H72組）。研究II（抑制劑實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證calpain對(duì)肌細(xì)胞膜損傷的影響）：40只大鼠隨機(jī)分為5組（每組n＝8），包括空白對(duì)照組（blank，B）、安慰劑（placebo，Pl）24 h和48 h組（Pl-24和Pl-48h組）和calpain抑制劑（inhibitor，I）24 h和48 h組（I-24和I-48h組）②24 h組伊文氏藍(lán)注射時(shí)間點(diǎn)為運(yùn)動(dòng)后即刻，48 h組伊文氏藍(lán)在運(yùn)動(dòng)后即刻和運(yùn)動(dòng)后24 h共注射2次。。

低氧EIMD動(dòng)物模型：除C組和B組外，各組大鼠均進(jìn)行4天常氧適應(yīng)跑臺(tái)訓(xùn)練，恢復(fù)后依據(jù)大鼠骨骼肌損傷模型（徐飛 等，2017；Armstrong et al.，1983）在低氧（氧濃度12.7%）下進(jìn)行間歇性大強(qiáng)度下坡跑（離心）運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)方案：速度26.8 m/min，坡度-16°，每組持續(xù)5 min，共10組，組 間間歇1 min。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖Figure 1. The Schematic Diagram of Experimental Design

1.2 取材及測(cè)試

1.2.1 腹腔注射伊文氏藍(lán)染色

腹腔注射伊文氏藍(lán)（evans blue dye，EBD）熒光染色劑（Sigma，USA），觀察膜通透性變化以鑒別損傷模型。常氧與低氧24 h、48 h和72 h組腹注時(shí)間分別為運(yùn)動(dòng)后即刻、運(yùn)動(dòng)后24 h和運(yùn)動(dòng)后48 h（圖1A）。EBD注射前經(jīng)Millex-GP 0.22 μm過濾器（Millipore，USA）滅菌，注射劑量為1 mg EBD/0.1 ml PBS（pH7.4）/10 g體重。

1.2.2 取材與處理

各組大鼠完成實(shí)驗(yàn)后，以2.3 ml/kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，然后迅速分離腓腸肌，取淺層中間段肌纖維，切塊凍存。于冰上切取3×3×5 mm3，OCT包埋后用液氮預(yù)冷的正己烷（-70℃）速凍，錫紙包裹后投入液氮，以制備冷凍切片。

1.2.3 鑒別肌細(xì)胞膜完整性

將EBD染色組織塊用Leica冰凍切片機(jī)（CM 1850，Germany）切成6 μm厚度樣本，熒光顯微鏡568 nm檢測(cè)。激光共聚焦顯微鏡（Leica sp8，Germany）觀察EBD切片，測(cè)量左、右、中部、上、下5個(gè)視野，IPP 6.0光密度分析軟件統(tǒng)計(jì)EBD陽(yáng)性細(xì)胞率（positive ratio of cells，PRC），鑒別肌細(xì)胞膜完整性。

1.2.4 注射calpain抑制劑

用0.1 M PBS配好的10% DMSO溶解calpain抑制劑MG-132（Selleck，USA），現(xiàn)配現(xiàn)用。大鼠運(yùn)動(dòng)后即刻腹腔注射MG-132（劑量15 mg/kg體重），然后置于低氧恢復(fù)，I-48、Pl-48組在24 h后再次注射。安慰劑組腹腔注射等量生理鹽水。各組取材要求及測(cè)試方法相同。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）

用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)calpain和膜骨架蛋白的mRNA表達(dá)，PCR擴(kuò)增引物（Invitrogen，USA）序列（5’to 3’）：calpain1上下游引物（105 bp）分別為AGACCATTGGTTTTGCAGTGTA、CTGATTGTGCCCGAGAAGC，calpain2上下游引物（205 bp）分別為GGCTTCGGCATCTATGAGGT、GAAATCGCCATTCTTGTGGG，calpain3上下游引物（100 bp）分別為TTTCAGACAGAGCAAACAGCAACAA、TGTGGGCTTTCCCCTTGTTTAT，dystrophin上下游引物（154 bp）分別為GTGTCCTCTCCTTCTACCTCGCT、 GCTCCATCACTTCTTCTAACCCTGT，utrophin上下游引物（144 bp）分別為CAAAAGCAAGTAGGAAAGGCGTTAG、ATCCTGCAGCGAGTCGATAAGC，dysferlin上下游引物（98 bp）分別為ATCATCCGAGCATTTGGCTTACA、TCCTGGTCACTCACTGATTTCTTCC，內(nèi)參GAPDH上下游引物（138 bp）分別為TGGAGTCTACTGGCGTCTT、TGTCATATTTCTCGTGGTTCA。用超純RNA試劑盒（CWbio，Cat#CW0581）提取組織樣本總RNA，取5 μl RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，用DNaseⅠ試劑盒（CWbio，Cat#CW2090）對(duì)RNA中殘留基因組DNA進(jìn)行消化處理，用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio，Cat#CW0744）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，ABI-7500型熒光定量PCR儀，2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析，嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.6 Western blot（WB）測(cè)定calpain及膜骨架蛋白的含量

取凍存的腓腸肌樣本剪碎，加入1 ml含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，在抽提蛋白前加入0.1 M PMSF母液（終濃度為1 mM）。根據(jù)選取測(cè)試樣本重量按溶液：裂解液體積（1：9）加入裂解液，以15 000 rpm進(jìn)行3次勻漿（每次10 s，間隔10 s）。勻漿時(shí)用冰水混合物浸泡進(jìn)行降溫，勻漿完成后于冰上孵育20 min，13 000 rpm 4℃離心20 min，然后取上清液分裝保存，待測(cè)。BCA法測(cè)定肌組織蛋白濃度，BCA工作液A液：B液＝50：1，稀釋各BSA標(biāo)準(zhǔn)品，樣品用PBS進(jìn)行稀釋。樣品：BCA工作液＝1：8，混勻后進(jìn)行60 min室溫孵育，用酶標(biāo)儀（570 nm波長(zhǎng)）讀取對(duì)應(yīng)OD值。

蛋白濃度調(diào)整：參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度求總蛋白量濃度，用RIPA調(diào)整蛋白濃度，加入5倍還原樣品緩沖液，樣品終濃度為4 mg/ml，煮沸變性5 min。據(jù)目的蛋白分子量，配制8%和12%的分離膠，濃縮膠濃度為5%，樣品上樣量為20 μg/孔。電泳條件：濃縮膠恒壓90 V、約20 min，分離膠恒壓160 V，通過預(yù)染蛋白marker確定電泳時(shí)間。用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅染色劑對(duì)膜染色并觀察轉(zhuǎn)膜效果。然后將膜浸沒在3%的BSA-TBST中，于室溫下輕搖30 min。再于室溫下孵育10 min，稀釋一抗后4 ℃過夜（一抗稀釋比例：calpain1α為1：2 000，calpain1β為1：4 000，calpain2為1：4 000，calpain3為1：1 000，dystrophin為1：2 000，utrophin為1：200，dysferlin為1：2 000）。次日4 ℃拿出膜后室溫孵育30 min，TBST洗膜5次（每次3 min）。二抗用5%脫脂奶粉-TBST稀釋，二抗：山羊抗兔IgG為1：20 000，山羊抗小鼠IgG為1：10 000，室溫輕搖40 min。TBST洗膜6次（每次3 min）。ECL加到膜上反應(yīng)3～5 min，發(fā)光顯影、膠片曝光、定影得到目的條帶圖像。采用ImageQuant TL軟件計(jì)算IOD值。β-tubulin（鼠單抗，1：2 000）作為內(nèi)參。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示。將對(duì)照組的值處理為1作為基線值，calpain和細(xì)胞膜骨架蛋白相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（與基線值的倍數(shù)關(guān)系）。雙因素方差分析（two-way ANOVA）考察低氧與暴露時(shí)間的主效應(yīng)和交互作用。交互作用不顯著時(shí)，只考察低氧主效應(yīng)對(duì)因變量的影響，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）；交互作用顯著時(shí)，用簡(jiǎn)單效應(yīng)分析估計(jì)邊際均數(shù)。多重比較（post-hoc）用LSD法，顯著性差異臨界值置為P＝0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型及膜損傷程度鑒定

EBD染色結(jié)果顯示（圖2），除C組外，EIMD后低氧和常氧各組肌細(xì)胞都有EBD侵入，切片結(jié)果顯示，H24和N48組更為明顯。PRC結(jié)果顯示，低氧各組與常氧對(duì)應(yīng)組之間有極顯著差異（P＜0.01）。且低氧與常氧組PRC呈現(xiàn)出不同的峰值特征和恢復(fù)趨勢(shì)：低氧組PRC峰值出現(xiàn)時(shí)間（24 h）早于常氧組峰值出現(xiàn)時(shí)間（48 h）。72 h時(shí)，常氧組PRC已顯著降低（N72 vs. N48組內(nèi)比較），低氧組PRC與H48組持平（膜損傷仍未恢復(fù)、且顯著高于常氧對(duì)應(yīng)組（H72 vs. N72，P＜0.01）。

圖2 低氧對(duì)EIMD后大鼠腓腸肌EBD熒光染色及陽(yáng)性細(xì)胞率的影響Figure 2. The Effect of Hypoxia on EBD of Gastrocnemius and Positive Ratio of Cells

2.2 低氧對(duì)EIMD后calpain和膜骨架蛋白mRNA表達(dá)的影響

2.2.1 低氧對(duì)EIMD后calpain mRNA表達(dá)的影響

低氧各組calpain1 mRNA表達(dá)與C組無顯著差異（P＞0.05），H72組顯著高于N72組（分別為1.067±0.360和0.783±0.178，P＜0.05，圖3A）。低氧各組calpain2 mRNA顯著高于C組，H72組顯著高于N72組（分別為1.736±0.970和1.437±0.671，P＜0.05，圖3B）。calpain3的mRNA表達(dá)無組間差異，但與calpain1和calpain2不同的是，低氧與常氧各組calpain3 mRNA隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低（圖3C）。

圖3 低氧對(duì)EIMD后calpain mRNA表達(dá)的影響Figure 3. The Effect of Hypoxia on mRNA Expression of Calpain after EIMD

2.2.2 低氧對(duì)EIMD后細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA表達(dá)的影響

EIMD后低氧與常氧各組dystrophin和utrophin的mRNA表達(dá)顯著低于C組。dystrophin和utrophin的mRNA表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，H24組顯著低于N24組（P＜0.01，圖4A、B）。utrophin的mRNA在72 h時(shí)出現(xiàn)上調(diào)，但組間無顯著差異（圖4B）。dysferlin的mRNA表達(dá)相對(duì)滯后，呈現(xiàn)先升高（48 h）后降低（72 h）的特征，組間無顯著差異（P＞0.05，圖4C）。

圖4 低氧對(duì)EIMD后膜骨架蛋白mRNA表達(dá)的影響Figure 4. The Effect of Hypoxia on mRNA Expression of Membrane Cytoskeleton after EIMD

2.3 低氧對(duì)EIMD后calpain和膜骨架蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 低氧對(duì)EIMD后calpain蛋白表達(dá)的影響

WB結(jié)果見圖5。雙因素方差分析結(jié)果顯示，低氧×?xí)r間對(duì)calpain蛋白量影響的交互作用不顯著（P＞0.05）。考察低氧主效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，低氧各組calpain1、calpain2和calpain3與常氧各組比較都無顯著差異（表1）。

2.3.2 低氧對(duì)EIMD后細(xì)胞膜骨架蛋白表達(dá)的影響

低氧×?xí)r間對(duì)膜骨架蛋白（dystrophin、utrophin、dysferlin）蛋白含量的交互作用不顯著（P＞0.05），但utrophin1（F＝2.769，P＝0.076）和utrophin2（F＝2.498，P＝0.097）接近顯著性差異臨界值（表2）?？疾斓脱踔餍?yīng)發(fā)現(xiàn)，低氧各組dystrophin-R、dystrophin-C和dysferlin蛋白量與常氧各組無顯著差異（P＞0.05），H72組utrophin1高于N72組（P＝0.030），兩組的utrophin2接近顯著差異臨界值（P＝0.056）。

2.4 抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 抑制劑對(duì)calpain1和calpain2蛋白表達(dá)的影響

抑制劑組（I-24、I-48組）calpain1α、calpain1β和calpain2的蛋白含量顯著低于B組（P＜0.05），安慰劑組（Pl-24、Pl-48組）與B組無顯著差異（P＞0.05）。I-24組calpain1α和calpain2顯著低于Pl-24組（圖6B、D），I-48組calpain1α、 calpain1β和calpain2與P1-48組相比，無顯著差異（P＞0.05）。

表1 低氧對(duì)EIMD后calpain蛋白表達(dá)的影響Table 1 The Effect of Hypoxia on Calpain Protein Expression after EIMD

表2 低氧對(duì)EIMD后肌細(xì)胞膜骨架蛋白表達(dá)的影響Table 2 The Effects of Hypoxia on Protein Expression of Membrane Cytoskeleton after EIMD

2.4.2 抑制calpain1和calpain2對(duì)肌細(xì)胞膜損傷的影響

激光共聚焦顯微鏡切片觀察結(jié)果顯示，B組肌細(xì)胞無明顯EBD染料侵入（圖7A、B）。calpain抑制劑組和安慰劑組肌細(xì)胞均有EBD侵入，Pl-24和Pl-48組更為明顯（圖7D、F）。PRC結(jié)果顯示，抑制劑24 h、48 h組PRC顯著低于安慰劑對(duì)應(yīng)組（分別為P＜0.01、P＜0.05），但仍顯著高于B組（分別為P＜0.05、P＜0.01，圖8）。安慰劑組（與研究I的低氧組為等效實(shí)驗(yàn)處理）PRC峰值（19.40±2.51）出現(xiàn)在24 h，與研究I中低氧組PRC的峰值（21.00±7.69）接近，出現(xiàn)時(shí)間（24 h）相同（圖2F）。

3 討論

3.1 低氧對(duì)EIMD后肌細(xì)胞膜損傷的影響

離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致EIMD的骨骼肌微損傷癥狀（Lieber et al.，1996；Nosaka et al.，1995）出現(xiàn)肌原纖維排列混亂和肌絲卷曲、斷裂等（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014），影響肌細(xì)胞膜的完整性和通透性（肌酸激酶升高、膜與細(xì)胞骨架分離、膜磷脂數(shù)量減少和磷脂降解產(chǎn)物堆積）（Cully et al.，2017；Hasenoehrl et al.，2017）。但尚不明確低氧對(duì)EIMD后肌細(xì)胞膜損傷的影響。本研究中，低氧和常氧各組EIMD后出現(xiàn)明顯EBD陽(yáng)性細(xì)胞，EBD與血清蛋白結(jié)合形成伊文氏藍(lán)—白蛋白復(fù)合物可被激光共聚焦顯微鏡檢出，若觀察到胞內(nèi)EBD陽(yáng)性細(xì)胞增加，則表明肌細(xì)胞膜完整性受損（Hamer et al.，2002；Lomonosova et al.，2014）。而低氧組PRC顯著高于常氧組和對(duì)照組也驗(yàn)證了EBD切片結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)低氧組PRC峰值前移和恢復(fù)延遲的現(xiàn)象（H72組PRC與H48組持平，并顯著高于N72組）。綜上，低氧提前了EIMD后膜損傷的時(shí)間并加劇了損傷程度。

圖6 抑制劑對(duì)calpain1、calpain2蛋白表達(dá)的影響Figure 6. The Effect of Inhibitor on Calpain1 and Calpain2 Protein Expression

圖7 抑制calpain1和calpain2對(duì)膜損傷的影響Figure 7. The Effect of Calpain1 and Calpain2 Inhibitor on Muscle Sarcolemma Injury

3.2 低氧對(duì)EIMD后calpain的影響

calpain是一種蛋白降解酶，主要作用于細(xì)胞、骨架蛋白、蛋白激酶和激素受體。calpain1和calpain2和calpain3最為常見，普遍認(rèn)為calpain對(duì)肌肉結(jié)構(gòu)、功能變化具有重要影響（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014；Murphy et al.，2009，2011）。但EIMD后低氧對(duì)calpain的影響與膜損傷的關(guān)系尚不明確。新近研究發(fā)現(xiàn)，低氧對(duì)calpain有激活作用（Hirata et al.，2015；Kovacs et al.，2016；Wang et al.，2016）。本研究RT-qPCR結(jié)果表明，低氧組calpain1、calpain2 mRNA顯著上調(diào)，與EIMD激活calpain的結(jié)果基本一致（Lomonosova et al.，2014）。此外，常氧組calpain1、calpain2 mRNA隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低（N72 vs. N48），低氧組mRNA隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加（H72 vs. H48）。結(jié)合PRC結(jié)果可知，常氧組calpain mRNA表達(dá)與PRC變化趨勢(shì)一致（mRNA下調(diào)－常氧組膜損傷緩解），低氧48h和72h組則相反（mRNA上調(diào)－低氧組膜損傷加?。Ｌ崾镜脱鯇?dǎo)致calpain1、calpain2基因表達(dá)上調(diào)與膜損傷加劇有關(guān)。這與新近研究證據(jù)吻合：低氧激活calpain1、calpain2后加速視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞死亡（Hirata et al.，2015）、激活calpain2后抑制肺動(dòng)脈高壓患者血管重塑（Kovacs et al.，2016）。

圖8 抑制calpain1和calpain2對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞率的影響Figure 8. The Effect of Calpain1 and Calpain2 Inhibitor on the Positive Ratio of Cells

因calpain3呈骨骼肌特異性高表達(dá)，Murphy等（2011）報(bào)道，EIMD后24 h會(huì)激活calpain3，所以推測(cè)低氧也可能激活calpain3。但有趣的是，盡管低氧各組calpain3的mRNA表達(dá)低于常氧各組，但并無顯著差異；更有意思的是，低氧與常氧各組的mRNA表達(dá)都隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低（H72 vs.H24），這與筆者的研究假設(shè)和calpain1、calpain2對(duì)低氧應(yīng)答的趨勢(shì)相反。所以，現(xiàn)有證據(jù)表明EIMD后低氧并未激活calpain3①本研究N24組calpain3的mRNA表達(dá)顯著高于C組（圖3C），與Murphy等（2011）發(fā)現(xiàn)離心運(yùn)動(dòng)短期內(nèi)激活calpain3的結(jié)果一致，說明大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)能夠激活calpain3，但這不是本研究要證明和關(guān)注的內(nèi)容，故并未展開討論。。Murphy等（2011）發(fā)現(xiàn)離心運(yùn)動(dòng)短期內(nèi)激活calpain3，但calpain3不能易位進(jìn)入細(xì)胞核和胞質(zhì)，實(shí)際上他們?cè)缙诹硪豁?xiàng)研究（Murphy et al.，2009）明確指出安靜時(shí)胞內(nèi)Ca2+濃度而非肌肉拉伸的離心運(yùn)動(dòng)才是激活內(nèi)源性calpain3的關(guān)鍵。本研究通過在體實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，EIMD后的低氧暴露并未激活calpain3，提示calpain3可能不是低氧導(dǎo)致膜損傷的主要途徑，也可能是EIMD－低氧－calpain3這個(gè)過程中存在某種調(diào)節(jié)calpain3的重要機(jī)制。但因缺乏更多有力的研究證據(jù)，還需進(jìn)一步證實(shí)。Spencer等（2002）指出，calpain3在正常小鼠肌肉中的高表達(dá)并無明顯的有害作用。就目前證據(jù)而言，究竟是calpain3在低氧導(dǎo)致膜損傷中不起重要作用，還是存在某種調(diào)控calpain3－膜損傷的機(jī)制，尚不得而知。這是多年來有關(guān)calpain3研究的一個(gè)謎團(tuán)，也是將來的研究無法回避的一個(gè)難點(diǎn)。

與mRNA不同的是，EIMD后低氧各組calpain1、calpain2和calpain3的蛋白含量與常氧各組都無顯著差異，提示，低氧對(duì)EIMD后calpain蛋白含量并無顯著影響。分析認(rèn)為，calpain蛋白含量與基因表達(dá)不一致并不矛盾，而蛋白含量無顯著變化，并不能否定低氧對(duì)calpain的激活效應(yīng)。首先，mRNA的豐度不一定與其翻譯產(chǎn)物（蛋白表達(dá)量）成線性關(guān)系，因?yàn)榛虮磉_(dá)調(diào)控層次很多，轉(zhuǎn)錄只是其中一個(gè)環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯后調(diào)控都會(huì)影響最終蛋白量；此外，mRNA降解、蛋白的降解和修飾折疊等因素都可能導(dǎo)致mRNA與蛋白表達(dá)水平不一致。其次，本研究mRNA增加表明EIMD和低氧雙重因素使calpain基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成趨勢(shì)的增加，而最終蛋白含量無顯著增加與calpain激活后的消耗有關(guān)。因?yàn)閏alpain是自溶性蛋白水解酶（最大特點(diǎn)是Ca2+激活和自溶式水解，通過被激活來降解其他蛋白），其在自溶水解和降解其他蛋白的同時(shí)自身也被消耗，所以calpain蛋白含量應(yīng)包括其降解其他蛋白所被消耗的部分。Murphy等（2006）也發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)不能使μ-calpain（calpain1）和calpain3的蛋白含量顯著增加，但其研究并未同步測(cè)試calpain的mRNA表達(dá)。另有多項(xiàng)研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)后calpain1和calpain3的mRNA表達(dá)顯著增加（Feasson et al.，2002；Jones et al.，2004），calpain的這種特殊性也體現(xiàn)在本研究結(jié)果中。

3.3 低氧對(duì)EIMD后細(xì)胞膜骨架蛋白降解的影響

肌細(xì)胞膜骨架蛋白與細(xì)胞骨架連接并與膜蛋白結(jié)合，維持膜生理功能。dystrophin及其同源蛋白u(yù)trophin（二者NH2端和COOH端相同）是肌細(xì)胞主要的肌節(jié)外調(diào)節(jié)蛋白（Freitas et al.，2016；Guiraud et al.，2017）。而高表達(dá)于骨骼肌的跨膜蛋白dysferlin主要參與膜的運(yùn)輸和融合修復(fù)（Bansal et al.，2003；Cardenas et al.，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧組dystrophin和utrophin的mRNA表達(dá)顯著低于常氧組（H24 vs. N24），蛋白含量并無顯著變化。而dysferlin的mRNA和蛋白含量都無顯著變化。膜骨架蛋白與肌原纖維肌動(dòng)蛋白（F-Actin）的多個(gè)結(jié)合區(qū)域（Bansal et al.，2003；Bartoli et al.，2005；Cardenas et al.，2016）是易被攻擊的部位，初步發(fā)現(xiàn)dystrophin蛋白結(jié)構(gòu)②是一個(gè)巨大蛋白，由3685個(gè)氨基酸組成，分子量約為427 kD。的中央竿狀區(qū)（R-rod，該蛋白主體結(jié)構(gòu)）易被大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)（機(jī)械牽拉）破壞，而dystrophin羧基端（COOH，dystrophin-C）的穩(wěn)定性易受低氧的影響（Stelter et al.，2016）和calpain的攻擊（Freitas et al.，2016）。但本研究發(fā)現(xiàn)，低氧加劇膜損傷時(shí)dystrophin-R、dystrophin-C蛋白并未丟失，說明EIMD后低氧加劇膜損傷，calpain被激活時(shí)該蛋白桿狀區(qū)和C端結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，這與本研究的研究假設(shè)相反。意外發(fā)現(xiàn)的是，dystrophin的mRNA和蛋白含量降低時(shí)，utrophin的mRNA和蛋白含量出現(xiàn)調(diào)節(jié)性增加，這印證了Guiraud等（2017）提出utrophin是杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥開發(fā)新藥和基因療法中新靶點(diǎn)的觀點(diǎn)。因?yàn)閐ystrophin與utrophin是同源蛋白且生理功能相似，但Guiraud等（2017）的新發(fā)現(xiàn)與膜損傷無直接聯(lián)系。

EIMD后低氧激活calpain、加劇膜損傷，但膜骨架蛋白并無顯著變化，說明EIMD后calpain在低氧加劇膜損傷過程中，并不是通過攻擊（降解）膜骨架蛋白dystrophin、utrophin和dysferlin的途徑，也即是說calpain導(dǎo)致膜損傷可能有其它機(jī)制，可能是降解其它關(guān)鍵的膜相關(guān)蛋白，也可能是calpain與上述3種膜骨架蛋白之間存在某種重要的調(diào)節(jié)和平衡機(jī)制（徐飛 等，2017）。但此推理成立的前提是calpain與膜損傷存在必然聯(lián)系，本研究和前人研究發(fā)現(xiàn)，膜損傷和/或肌纖維損傷（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014）時(shí)calpain有相應(yīng)變化，只能說明二者存在相關(guān)關(guān)系，而非因果關(guān)系。綜上，確認(rèn)EIMD后低氧加劇膜損傷中calpain的角色是機(jī)制研究的關(guān)鍵點(diǎn)。

3.4 calpain抑制效果評(píng)價(jià)及對(duì)肌細(xì)胞膜損傷的影響

低氧會(huì)導(dǎo)致骨骼肌廢用性萎縮和適應(yīng)性萎縮（D’Hulst et al.，2013），calpain自溶式激活降解蛋白的特性對(duì)骨骼肌適應(yīng)有重要作用（Kanzaki et al.，2017）。研究證實(shí),離心運(yùn)動(dòng)后24 h大鼠股四頭肌超微結(jié)構(gòu)受損，calpain被激活（calpain1、calpain2蛋白含量顯著增加）（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014）。但上述研究未能通過在體或/和離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制或激活calpain對(duì)膜損傷的影響。本研究采用的calpain抑制劑（MG-132）通過結(jié)合calpain中心基團(tuán)，使蛋白酶失活或活力下降（但并不使蛋白變性），已應(yīng)用于心?。ˋdams et al.，2015）和骨骼肌（Joung et al.，2014）細(xì)胞損傷和修復(fù)的機(jī)制研究。本研究發(fā)現(xiàn)，MG-132使calpain1α和calpain2的蛋白表達(dá)量顯著降低，calpain1β也低于安慰劑組，說明calpain活性得到有效抑制，calpain1α和calpain2的抑制效果優(yōu)于calpain1β。從蛋白結(jié)構(gòu)來看，被激活的calpain1（有蛋白降解功能）是由大亞基α（催化區(qū)，80 kD）和小亞基β（調(diào)節(jié)區(qū)，30 kD）組成，calpain1α是兩個(gè)相關(guān)基因的產(chǎn)物，calpain1β是單個(gè)基因的產(chǎn)物。Kanzaki等（2017）通過大鼠在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制calpain活性對(duì)離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的快肌纖維損傷有顯著保護(hù)作用，且保護(hù)機(jī)制與蘭尼定受體和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶途徑無直接關(guān)系。綜合觀察實(shí)驗(yàn)（金其貫 等，2010，2011；Lomonosova et al.，2014）、抑制實(shí)驗(yàn)（Kanzaki et al.，2017）和本研究結(jié)果，提示，抑制calpain活性對(duì)肌細(xì)胞膜損傷有保護(hù)作用。

肌細(xì)胞膜EBD染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組肌細(xì)胞無明顯EBD染料侵入，抑制劑組和安慰劑組都觀察到EBD侵入細(xì)胞。結(jié)合抑制劑組PRC顯著低于安慰劑組的結(jié)果，說明抑制calpain1、calpain2能減輕膜損傷程度（對(duì)維持膜的完整性和正常功能有促進(jìn)作用），而calpain1α和calpain2的作用可能大于calpain1β。這也在一定程度上從另一個(gè)角度證實(shí)，F(xiàn)reitas等（2016）離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激活calpain會(huì)加速肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（dystrophin）丟失而惡化膿毒性心肌病的結(jié)果（本研究的在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EIMD后低氧激活calpain不是通過攻擊dystrophin蛋白引起膜損傷，F(xiàn)reitas等采用心肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，沒有EIMD和低氧刺激）。本結(jié)果也支持Kanzaki等（2017）的研究結(jié)果。但需指出的是，雖然抑制calpain活性能有效減輕膜損傷，但效果并不是十分理想，因?yàn)橐种苿└鹘MPRC仍顯著高于對(duì)照組，所以除calpain1、calpain2機(jī)制外，可能還有其它機(jī)制調(diào)控EIMD后低氧對(duì)膜損傷的過程（徐飛 等，2017）。推測(cè)與miRNA調(diào)控mRNA－蛋白表達(dá)過程有關(guān)（一個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，多個(gè)miRNA組合也可精細(xì)調(diào)控單個(gè)基因的表達(dá)），已發(fā)現(xiàn)骨骼肌特異性表達(dá)的miRNA（miRNA-1、miRNA-133、miRNA-206）能精細(xì)調(diào)控calpain降解膜骨架蛋白的過程（Mancinelli et al.，2016）。Roudaut等（2013）也觀察到miRNA調(diào)控calpain3基因缺失導(dǎo)致LGMD大鼠骨骼肌dystrophin蛋白的表達(dá)。所以這可能是將來calpain激活與膜損傷機(jī)制研究的一個(gè)重要方向。

4 結(jié)論

1. calpain1、calpain2被激活與低氧加劇大鼠EIMD后肌細(xì)胞膜損傷有關(guān)，但calpain并非通過降解膜骨架蛋白dystrophin、utrophin和dysferlin而導(dǎo)致膜損傷。

2. 抑制calpain1、calpain2活性能有效減輕但不能避免低氧加劇EIMD后的膜損傷，其中還可能存在其它調(diào)節(jié)機(jī)制。