任彥紅 陳 丹 張廣超 郭 青 沈照波 孫曉敏

肺炎支原體肺炎(mycoplasmapneumoniaepenumonia，MPP)是由于感染肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)導(dǎo)致兒童呼吸系統(tǒng)肺等產(chǎn)生炎癥的一種常見非典型性肺炎。其中大多數(shù)支原體感染導(dǎo)致的肺炎病情較輕，對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感，療效好，但由于MP病原菌耐藥性、多種病原混合感染和患兒免疫功能損傷等因素，導(dǎo)致某些支原體肺炎患兒較為難治[1]。流行病學(xué)研究表明，近年來兒童難治性肺炎支原體肺炎(refractory MPP，RMPP)在獲得性肺炎病例中比例明顯增高，其在兒童疾病中致死率也相對升高[2]。然而，關(guān)于RMPP的致病原因尚不完全明確，臨床治療顯示在感染早期采用糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療，有利于抑制MPP疾病進(jìn)展，控制病情[3]。因此，盡早準(zhǔn)確診斷對于及時(shí)進(jìn)行治療、減少RMPP發(fā)生、改善患兒預(yù)后具有重要臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，血清中25羥維生素D[25-hydroxy vitamin D，25(OH)D]含量是衡量人體內(nèi)維生素D水平的有效指標(biāo)，一定程度上可反映人體免疫水平；甲殼質(zhì)酶蛋白40(YKL-40)是巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等合成、釋放的分泌型蛋白質(zhì)，在機(jī)體處于炎癥狀態(tài)時(shí)其血漿水平升高，可反映機(jī)體炎癥狀態(tài)[4，5]。然而其在RMPP早期診斷中的作用尚不清楚。因此，本研究通過檢測MPP患兒血清中25(OH)D、YKL-40水平并進(jìn)行分析，旨在探究二者對兒童RMPP的早期診斷價(jià)值。

材料與方法

1.一般資料：選取2016年4月～2018年1月筆者醫(yī)院收治的肺炎支原體肺炎患兒107例為研究對象，據(jù)RMPP診斷標(biāo)準(zhǔn)將MPP患兒分為普通支原體肺炎(ordinary MPP，OMPP)組67例，難治性支原體肺炎(RMPP)組40例。MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)按照《實(shí)用兒科學(xué)》第7版相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)：患兒劇烈持續(xù)性咳嗽，胸片顯示兩肺有斑片或點(diǎn)網(wǎng)狀陰影，白細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；蛏晕⑵撸蟓h(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對其治療效果好，MP特異性抗體IgM呈陽性[6]。RMPP診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《兒科難治性疾病管理指南》(2013年)中標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定：采用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物正規(guī)治療超過1周，咳嗽、發(fā)熱等臨床癥狀未減輕，呈進(jìn)行性加重，肺外其他系統(tǒng)出現(xiàn)并發(fā)癥，且胸片顯示肺部陰影加劇的MPP患兒即可診斷為RMPP[7]。MPP患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)且排除其他造成肺部感染病因的患兒；②患兒年齡5～12歲；③病程≤7天；④一般資料及病理資料完整患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他病原菌感染患兒；②合并有反復(fù)呼吸道感染、先天性免疫缺陷疾病患兒；③病程超過7天患兒；④肺炎恢復(fù)期住院患兒；⑤中途未遵醫(yī)囑進(jìn)行治療患兒。選取同期與筆者醫(yī)院門診進(jìn)行體檢的健康兒童55例為對照組。本研究通過筆者醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)并取得患兒家屬知情同意。

2.臨床資料收集：記錄所有MPP患兒一般資料及臨床資料，包括患兒年齡、性別、住院時(shí)病程、發(fā)熱時(shí)間、肺外并發(fā)癥、肺部啰音、呼吸音情況、胸腔積液情況、肺部壞死性炎癥情況等資料。

3. 血清25(OH)D及YKL-40蛋白水平檢測：于入院2h內(nèi)采集所有MPP患兒靜脈血(2毫升/人)，4℃下，3000r/min離心10min，收集上層血清，采用人25(OH)D ELISA試劑盒(貨號：SBJ-H1130，南京森貝伽生物公司)、人YKL-40 ELISA試劑盒(貨號：CSB-E13608h，武漢華美生物工程公司)檢測各患兒血清中25(OH)D、YKL-40水平，具體步驟如下：①將特異性抗體球蛋白用包被緩沖液稀釋至5μg/ml，每凹孔加0.4ml，4℃過夜；②緩沖液洗3次，加入0.2ml血清，37℃孵育60min；③緩沖液洗3次，加入酶標(biāo)抗體anti-25(OH)D、anti-YKL-40，37℃孵育60min；④緩沖液洗3次后，加入0.2ml酶的作用底物，室溫孵育30min；⑤加0.05ml檸檬酸(2mol/L)終止反應(yīng)，檢測492nm下吸光度(A)值。

結(jié) 果

1.MPP患兒與健康兒童血清25(OH)D、YKL-40水平的比較：與對照組健康兒童比較，MPP組支原體肺炎患兒血清中25(OH)D水平明顯降低，YKL-40蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表1。

2.血清25(OH)D、YKL-40水平對MPP的診斷價(jià)值：ROC曲線分析顯示，血清25(OH)D、YKL-40水平表現(xiàn)出對MPP患兒與健康兒童較強(qiáng)的區(qū)分能力。血清25(OH)D對MPP患者診斷的ROC曲線下面積為0.732，95%CI：0.679～0.881(P<0.05)，以21.09ng/ml為截?cái)嘀翟\斷MPP敏感度為56.97%，特異性為82.86%，詳見圖1A；血清YKL-40對MPP患者診斷的ROC曲線下面積為0.679，95%CI：0.536～0.791(P<0.05)，以36.57ng/ml為截?cái)嘀翟\斷MPP敏感度為50.79%，特異性為78.58%，詳見圖1B。

表1 MPP患兒與健康兒童血清25(OH)D、YKL-40水平的比較

圖1 血清25(OH)D、YKL-40水平對MPP診斷的ROC曲線分析

3.血清25(OH)D、YKL-40水平與MPP患兒臨床病理特征的關(guān)系：根據(jù)ROC曲線所取截?cái)嘀祵PP患兒分為25(OH)D高水平組43例、25(OH)D低水平組64例和YKL-40高表達(dá)組62例、YKL-40低表達(dá)組45例。25(OH)D低水平者肺炎患兒肺部啰音、呼吸音低、胸腔積液、肺部壞死性炎癥等發(fā)生率明顯高于25(OH)D高水平者(P<0.05)；25(OH)D低水平者肺炎患兒的性別構(gòu)成、年齡構(gòu)成、發(fā)熱時(shí)長、肺外并發(fā)癥發(fā)生率與25(OH)D高水平者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。YKL-40高表達(dá)者肺炎患兒中肺外并發(fā)癥、肺部啰音、呼吸音低、胸腔積液、肺部壞死性炎癥等發(fā)生率明顯高于YKL-40低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；YKL-40高表達(dá)者肺炎患兒的性別構(gòu)成、年齡構(gòu)成、發(fā)熱時(shí)長與YKL-40低表達(dá)者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

4.RMPP患兒與OMPP患兒血清25(OH)D、YKL-40水平比較：與OMPP組肺炎患兒比較，RMPP組患兒血清25(OH)D水平明顯降低，YKL-40蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表3。

5.血清25(OH)D、YKL-40水平對RMPP的診斷價(jià)值：ROC曲線分析顯示，血清25(OH)D、YKL-40水平表現(xiàn)出對RMPP患兒和OMPP患兒較強(qiáng)的區(qū)分能力。血清25(OH)D對MPP患者診斷的ROC曲線下面積為0.751，95%CI：0.614～0.877(P<0.05)，以18.57ng/ml為截?cái)嘀翟\斷RMPP敏感度為55.95%，特異性為81.66%，詳見圖2A；血清YKL-40對MPP患者診斷的ROC曲線下面積為0.797，95%CI：0.683～0.954(P<0.05)，以38.59ng/ml為截?cái)嘀翟\斷RMPP敏感度為63.76%，特異性為84.07%，詳見圖2B。

討 論

RMPP一般指經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療7天以上，未見明顯療效者，是MPP疾病中較為難治的一種。近年來，隨著β內(nèi)酰胺類抗生素的推廣使用，兒童RMPP發(fā)生率逐年升高。RMPP疾病病程進(jìn)展迅速，易引發(fā)肺壞死等嚴(yán)重肺內(nèi)并發(fā)癥，對患兒心臟、肝臟、腦等多器官造成損傷，導(dǎo)致多器官功能障礙，嚴(yán)重者進(jìn)展為壞死性肺炎，甚至死亡[8]。研究發(fā)現(xiàn)，對早期RMPP患兒加用糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療，可有效控制肺炎病情發(fā)展，改善患兒預(yù)后，治療效果明顯[3]。因此，探索與RMPP發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，尋找敏感度、特異性較高的RMPP診斷生物標(biāo)志物，可為早期精確診斷、后期靶向治療及改善RMPP患者預(yù)后提供新思路。

表2 血清25(OH)D、YKL-40水平與MPP患兒臨床病理特征的關(guān)系

表3 RMPP患兒與OMPP患兒血清25(OH)D、YKL-40水平比較

維生素是維持人和動(dòng)物正常生理功能的一類微量有機(jī)物，自身不可合成產(chǎn)生，依靠從食物中攝取，在人體生長、發(fā)育及代謝等生物過程中具有重要作用[9]。其中維生素D是一類脂溶性固醇類維生素，其活性形式為1,25(OH)D半衰期很短，在人體血清中多以穩(wěn)定的前提形式25(OH)D存在，一定程度上可反映人體維生素D狀態(tài)[10]。鄧永超等[11]研究發(fā)現(xiàn)，維生素D水平較低的兒童，免疫力較低，COX分析顯示，維生素D水平較低是兒童發(fā)生肺炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，重癥肺炎患兒肺內(nèi)皮細(xì)胞中25(OH)D水平顯著低于輕癥患兒，提示維生素D水平較低是影響肺炎由輕癥進(jìn)展為重癥的因素之一。

Thuesen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，25(OH)D低水平哮喘患者FEV1%等肺功能較低，提示25(OH)D與哮喘患者肺功能有關(guān)。另外，Rathored等[13]發(fā)現(xiàn)，耐多藥性結(jié)核病患者血清25(OH)D水平顯著低于普通結(jié)核患者。MPP發(fā)病的根本原因即在于機(jī)體免疫水平低，免疫系統(tǒng)不能成功抵御支原體病菌感染，因此本研究推測血清25(OH)D水平可能與MPP疾病發(fā)生有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MPP患兒血清中25(OH)D水平明顯低于健康兒童，表明25(OH)D水平較低可能是MPP疾病發(fā)生的原因之一。ROC曲線分析顯示，血清25(OH)D對MPP患者診斷的AUC為0.732，表明血清25(OH)D水平對MPP患兒和健康兒童之間有較強(qiáng)的區(qū)分能力，提示檢測兒童血清25(OH)D水平能較準(zhǔn)確地診斷MPP疾病。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清25(OH)D水平與MPP患兒肺部啰音、呼吸音低、胸腔積液、肺部壞死性炎癥發(fā)生率有關(guān)，提示25(OH)D可能參與MPP疾病進(jìn)展。

圖2 血清25(OH)D、YKL-40水平對RMPP診斷的ROC曲線分析

甲殼質(zhì)酶蛋白40是一種由巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等合成、釋放的分泌型蛋白質(zhì)，因其N端起始氨基酸為酪氨酸(tyrosine，Y)、賴氨酸(lysine，K)和亮氨酸(leucine，L)而被稱為YKL-40[14]。研究表明，機(jī)體中YKL-40過表達(dá)在多種炎癥相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，參與調(diào)解炎性相關(guān)因子表達(dá)、細(xì)胞增殖、組織重塑等生理病理過程[15]。Corradi等[16]發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者血清YKL-40濃度顯著升高，檢測血清YKL-40水平可顯著提高肺癌的診斷特異性。Korthagen等[17]發(fā)現(xiàn)，循環(huán)YKL-40水平在纖維性間質(zhì)性肺炎中顯著升高，與纖維化程度和炎癥的活動(dòng)程度有關(guān)，提示血清YKL-40水平可能與肺部病變的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但YKL-40在MPP疾病中作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，MPP患兒血清中YKL-40蛋白水平顯著高于健康兒童，血清YKL-40對MPP患者診斷的AUC為0.679，表明血清YKL-40蛋白水平對MPP患兒和健康兒童之間有一定區(qū)分能力，提示檢測兒童血清25(OH)D水平可能較準(zhǔn)確地診斷MPP疾病。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清YKL-40蛋白水平與MPP患兒肺外并發(fā)癥、肺部啰音、呼吸音低、胸腔積液、肺部壞死性炎癥發(fā)生率有關(guān)，表明血清YKL-40蛋白水平與MPP疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，提示YKL-40參與MPP疾病進(jìn)展。

根據(jù)RMPP診斷標(biāo)準(zhǔn)，可將MPP患兒分為OMPP患兒和RMPP患兒，其中RMPP患兒常常伴隨肺內(nèi)及肺外多臟器并發(fā)癥，導(dǎo)致多器官衰竭，病死率更高，治療的重點(diǎn)在于早期糖皮質(zhì)激素藥物的介入處理和感染的及時(shí)有效控制[18]。因此，RMPP的準(zhǔn)確診斷有利于區(qū)分OMPP和RMPP患者，從而盡早給與合理干預(yù)，控制患兒病情進(jìn)程，改善預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)與OMPP組肺炎患兒比較，RMPP組患兒血清25(OH)D水平明顯降低，YKL-40蛋白水平顯著升高，表明25(OH)D、YKL-40可能與RMPP發(fā)生相關(guān)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清25(OH)D、YKL-40水平表現(xiàn)出對RMPP患兒和OMPP患兒較強(qiáng)的區(qū)分能力，且血清25(OH)D對MPP患者診斷的AUC為0.751，血清YKL-40對MPP患者診斷的AUC為0.797，敏感度及特異性較高，提示檢測MPP患者血清25(OH)D、YKL-40水平可用于RMPP的初步診斷，且血清YKL-40水平對RMPP的診斷價(jià)值更高。然而25(OH)D、YKL-40在MPP疾病發(fā)生、發(fā)展中作用機(jī)制仍不明確，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探究。

綜上所述，MPP患者血清25(OH)D水平較低，YKL-40水平較高，二者對MPP具有較高診斷價(jià)值，且在OMPP患兒和RMPP患兒中呈現(xiàn)顯著差異，對RMPP的診斷具有一定價(jià)值，推測檢測血清25(OH)D、YKL-40水平可能應(yīng)用于RMPP的診斷和早期篩查。