李躍中 楊亞冬 楊 耿 羅 濤 徐怡朦 唐 靚 張文元

肺是一個(gè)由40多個(gè)不同的細(xì)胞類(lèi)型組成的復(fù)雜器官，它有很大的表面積界面，廣泛地與環(huán)境與循環(huán)系統(tǒng)接觸。隨著年齡的增長(zhǎng)，肺功能損失正越來(lái)越成為嚴(yán)重的醫(yī)療保健問(wèn)題[1]。肺臟疾病是目前發(fā)生率和病死率較高的疾病之一，肺組織在成人慢性破壞后再生能力有限，許多肺部疾患缺乏足夠有效的治療方式[2～4]。肺移植手術(shù)在終末期肺疾病的治療中已被廣泛接受，但存在供體嚴(yán)重缺乏，而且還存在慢性免疫排斥、術(shù)后感染并發(fā)癥和潛在的疾病傳播等不良反應(yīng)[5]。組織工程肺的構(gòu)建和應(yīng)用有望解決以上難題，肺基質(zhì)的再接種是肺再生的一種可行的策略[6]。但是，由于肺組織結(jié)構(gòu)和生理功能的復(fù)雜性，目前肺組織工程研究尚無(wú)重大進(jìn)展[7]。構(gòu)建一個(gè)有功能、可移植的組織工程肺面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。3D生物打印技術(shù)有望突破傳統(tǒng)組織工程技術(shù)的局限與障礙，構(gòu)建工程化組織與器官。本實(shí)驗(yàn)將新生兔肺混合細(xì)胞-海藻酸鈉-明膠共混物3D生物打印的水凝膠結(jié)構(gòu)體片段植入兔背部皮下，并通過(guò)HE染色與Masson染色觀察植入后水凝膠結(jié)構(gòu)體中的肺混合細(xì)胞的存活情況，以便為肺臟的再生研究提供新思路。

材料與方法

1.主要器材和試劑：海藻酸鈉、明膠(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，無(wú)水CaC12(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，鈣黃綠素-AM(calcein-AM，CAM)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)均為Solarbio產(chǎn)品，低糖-DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)，6孔塑料培養(yǎng)板(美國(guó)Costar公司)。3D生物打印機(jī)(Bioscaffolder 2.1，GESIM公司，德國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司，IX73)。新西蘭白兔，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(浙)2013-0055號(hào)。

2.新生兔原代肺混合細(xì)胞的提?。盒律挛魈m白兔，1日齡，體質(zhì)量約160g，雌雄不限。斷頭處死后，浸入75%乙醇5min消毒。無(wú)菌操作下取出肺臟，修剪周邊，除去雜質(zhì)。反復(fù)沖洗后，用眼科剪將肺組織剪碎約為1mm3的細(xì)小碎塊。加入5倍于組織碎塊體積量的0.25%胰蛋白酶，吸管吹打混勻后37℃孵育8min，吸出已消化的細(xì)胞懸液，加到含10%胎牛血清的低糖-DMEM培養(yǎng)基中，中止消化。將上述消化過(guò)的肺組織小碎塊同法再消化1次，再次吸出已消化的細(xì)胞懸液，并再中止消化。合并細(xì)胞懸液，充分混合均勻，200目不銹鋼篩過(guò)濾，1000r/min離心5min，D-PBS清洗細(xì)胞1次，再次1000r/min離心5min。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)，確認(rèn)細(xì)胞存活率90%后，用于如下實(shí)驗(yàn)。

3.三維(3D)生物打印肺結(jié)構(gòu)體：參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。(1)制備肺細(xì)胞共混物:1.6g海藻酸鈉干粉、0.6g明膠干粉加于20ml生理鹽水中，低速攪拌混勻，形成水溶膠。每天70℃×30min水浴，連續(xù)3天間歇滅菌。然后將滅菌后的水溶膠與兔原代肺混合細(xì)胞懸液混合，輕柔混勻，經(jīng)300×g離心3min，使氣泡消失。得到細(xì)胞密度為1×107cells/ml的肺混合細(xì)胞-水溶膠共混物。(2)CAD建模：構(gòu)建尺寸為8mm×8mm×1.2mm的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，微絲逐層交錯(cuò)堆積形成的孔隙大小設(shè)定為600μm×600μm。成形溫度設(shè)定為10℃，打印噴頭內(nèi)徑為0.26mm，打印速率為17mm/s，空氣擠出壓力370kPa，層高0.20mm，料桶溫度32℃，共打印8層。(3)制備肺細(xì)胞結(jié)構(gòu)體:將肺細(xì)胞共混物置于料桶中，由空氣氣壓推動(dòng)柱塞水溶膠擠出成形。擠出的微絲逐層交錯(cuò)堆積于6孔培養(yǎng)板上。打印后立即用5%CaCl2溶液交聯(lián)5min，生理鹽水漂洗3次。獲得半透明網(wǎng)格狀帶氣孔的、有較高孔隙率的肺混合細(xì)胞-海藻酸鈉-明膠三維結(jié)構(gòu)體，詳見(jiàn)圖1。

圖1 3D生物打印的肺混合細(xì)胞-海藻酸鈉-明膠三維結(jié)構(gòu)體

4.新生兔肺細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的觀察：對(duì)打印的肺細(xì)胞結(jié)構(gòu)體用活/死細(xì)胞雙熒光染色劑(含5μmol/L的鈣黃綠素-AM，其激發(fā)波長(zhǎng)為488nm；以及含3μmol/L的碘化丙啶，其激發(fā)波長(zhǎng)為543nm) 37℃染色30min。用熒光倒置顯微鏡分別在488nm和543nm的激發(fā)光下對(duì)結(jié)構(gòu)體進(jìn)行觀察，保存圖像，并合并這兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)的圖像。分別任選5個(gè)圖像，計(jì)數(shù)圖像中的紅、綠熒光點(diǎn)(紅、綠光點(diǎn)分別代表死細(xì)胞、活細(xì)胞)個(gè)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率為活細(xì)胞占全部活死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

5.肺細(xì)胞結(jié)構(gòu)體植入兔背部：選取健康新西蘭白兔10只，3月齡，體重約2kg，雌雄不限，隨機(jī)分為2組，每組5只。3%戊巴比妥鈉1ml/kg(即30mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，于背部沿正中進(jìn)行脫毛、消毒、鋪巾，無(wú)菌條件下，垂直作1個(gè)長(zhǎng)約1.7cm的切口，切開(kāi)背部皮膚。實(shí)驗(yàn)組：每只兔皮下左右兩側(cè)各植入1片肺細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，間距3cm。對(duì)照組：同法植入不含肺細(xì)胞的結(jié)構(gòu)體。術(shù)后全部動(dòng)物于腹部青霉素連續(xù)注射3天，每只動(dòng)物500000U/d。單籠飼養(yǎng)，任其自由活動(dòng)，并觀察生存、飲食、活動(dòng)情況。

6.植入物的組織病理學(xué)檢查：植入2周后，將10只動(dòng)物全部耳緣靜脈空氣針處死。大體觀察后，行組織切片染色觀察。取適量植入物固定，石蠟包埋、切片，HE染色和Masson染色，光鏡觀察。

結(jié) 果

1.原代肺混合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)分離的新生兔原代肺混合細(xì)胞分布均勻，光澤度良好，細(xì)胞以類(lèi)圓球形為主，還有不規(guī)則的多角形、三角形等，細(xì)胞飽滿(mǎn)清晰，細(xì)胞活力良好，詳見(jiàn)圖2。

圖2 新生兔原代肺混合細(xì)胞(×200)

2.三維結(jié)構(gòu)體的肺混合細(xì)胞存活率：肺混合細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體打印后，通過(guò)活/死細(xì)胞雙熒光染色，熒光倒置顯微鏡觀察可見(jiàn)，絕大多數(shù)細(xì)胞呈綠色熒光染色的活細(xì)胞，極少量細(xì)胞為染成紅色的死細(xì)胞，詳見(jiàn)圖3。對(duì)活、死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率為83%±2%。

圖3 打印后肺混合細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體的雙熒光染色(×100)

3.植入物支架的組織學(xué)觀察：體內(nèi)植入2周后，可見(jiàn)每個(gè)植入物大部分尚未降解。HE、Masson染色結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組植入物中肺細(xì)胞均勻分布，未見(jiàn)細(xì)胞變性及死亡(圖4中A、C)。對(duì)照組很少見(jiàn)有細(xì)胞(圖4中B、D)。

圖4 植入支架的組織學(xué)染色(×400)

討 論

海藻酸鈉、明膠是常用的生物打印材料[9,10]。明膠具有溫度敏感性，溫度較低時(shí)可由溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，使支架得以成形。打印后水凝膠經(jīng)CaCl2交聯(lián)，使支架結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)固。

傳統(tǒng)組織工程技術(shù)是將細(xì)胞接種于支架表面，細(xì)胞難以向內(nèi)部生長(zhǎng)，尤其是支架中心部位細(xì)胞生長(zhǎng)極少，難以構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜及具功能活性的工程化組織[11]。而3D生物打印技術(shù)能定位裝配生物材料及細(xì)胞單元，能夠控制細(xì)胞的落點(diǎn)與分布。它改變了傳統(tǒng)組織工程難以將細(xì)胞深入到支架內(nèi)部的弊端，為細(xì)胞生長(zhǎng)和新陳代謝提供了一個(gè)較為合適的環(huán)境[12]。3D生物打印的肺臟結(jié)構(gòu)體除了用于移植之外，還可用于體外模擬肺臟進(jìn)行藥物毒性及安全性評(píng)估高通量篩選、藥物有效性測(cè)試與新藥發(fā)現(xiàn)測(cè)試，以及未來(lái)藥物治療設(shè)計(jì)，甚至器官替代[13～15]。構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)的3D環(huán)境，以及細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題可以通過(guò)3D生物打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)與解決[16]。生物打印的可移植支架最終將被用作治療手段，打印適合于移植的類(lèi)肺組織可能是克服供體短缺和手術(shù)并發(fā)癥等問(wèn)題的一個(gè)現(xiàn)實(shí)選擇，將于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床之間搭建橋梁，可為肺再生領(lǐng)域提供一個(gè)新的醫(yī)學(xué)范例。

然而，在組織工程中應(yīng)用的3D生物打印技術(shù)仍處于初級(jí)階段，需要進(jìn)一步的改進(jìn)。作為一種移植物，打印組織的功能比形狀更重要，阻礙大規(guī)模肺組織再生的一個(gè)主要障礙是缺乏伴生的微血管[17]。組織器官需要進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與氧氣的傳輸，以及代謝廢物的排出。這些都需要有血管或類(lèi)血管進(jìn)行血液循環(huán)才能完成。不然，處于核心區(qū)域的細(xì)胞會(huì)很快死亡。但是血管細(xì)又長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難打印構(gòu)建。因此，在血管化、可重復(fù)性方面，還需要開(kāi)展更多的研究[18]。

基于文獻(xiàn)報(bào)道，原代分離獲得的肺混合細(xì)胞群中含有上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、Ⅰ型及Ⅱ型肺泡細(xì)胞，證明了肺混合細(xì)胞群由多種細(xì)胞構(gòu)成[1,11,19]。為此本實(shí)驗(yàn)采用從新生兔肺臟中分離肺混合細(xì)胞作為種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)將原代肺混合細(xì)胞-海藻酸鈉-明膠共混物逐層交叉堆積而成網(wǎng)格狀圖案的水凝膠3D支架片段，支架里具有逐層交叉的氣孔與較高的孔隙率，適于營(yíng)養(yǎng)物攝入與代謝廢物排泄等物質(zhì)交換。結(jié)果表明網(wǎng)格模式的生物打印過(guò)程并沒(méi)有顯著影響肺細(xì)胞的活力。原代肺混合細(xì)胞-海藻酸鈉-明膠共混網(wǎng)格狀圖案的水凝膠3D支架片段在兔背部皮下可形成帶有肺細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的潛力。由于肺組織結(jié)構(gòu)和生理功能的復(fù)雜性，構(gòu)建具有功能和可供移植的人工肺臟仍是一個(gè)極為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。