袁玉娟 尼菲拉·甫拉緹 依力哈木·阿布力提甫 穆葉賽·尼加提

隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病在發(fā)展中國家也有明顯的增長趨勢，專家們推測2020年它將成為世界頭號殺手[1]。缺血性心臟病中致死性最強的急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)，發(fā)生率呈逐年增加趨勢[2]。

ACS 是指冠心病中急性發(fā)病的臨床類型，以急性心肌缺血為共同特征的一組臨床綜合征，其包括急性心肌梗死(AMI)和不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)患者。ACS 的發(fā)病急、病情重、病死率高，1/2的心血管死亡原因歸結(jié)為ACS，因而需要早期預(yù)防、診斷和治療。隨著冠脈血管血運重建技術(shù)逐漸普及與成熟，以及多種抗血小板及抗凝藥物的聯(lián)合使用大大降低了ACS患者發(fā)生急性血栓事件的概率，但是粥樣硬化斑塊基礎(chǔ)上形成血栓的分子生物學(xué)機制仍不清楚。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，血栓的形成不僅與血小板、內(nèi)皮細胞、組織因子(TF)有關(guān)，動脈粥樣硬化病灶局部及斑塊發(fā)生破裂的冠狀動脈局部血液中存在促凝血活性的微粒，是由細胞內(nèi)吞作用形成的管腔內(nèi)磷脂囊泡，其直徑為0.1～1.0μm，來源包括血小板、紅細胞和內(nèi)皮細胞等，數(shù)量完全取決于細胞的激活或者凋亡[3～6]。現(xiàn)在越來越多的研究證明微?？勺鳛楹芏嘞到y(tǒng)疾病診斷及治療的生物標(biāo)志物，包括心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤疾病[7～10]。

前期研究發(fā)現(xiàn) ACS 患者的外周血微粒水平明顯升高，其中紅細胞源微粒、血小板源微粒以及內(nèi)皮細胞源微粒參與了 ACS 的發(fā)生、發(fā)展過程。筆者在體外將 ACS 患者血漿中提取的不同濃度紅細胞源微粒和血小板源微粒加入非冠心病患者血漿中，發(fā)現(xiàn)微粒誘導(dǎo)血栓形成的峰值前移，提示紅細胞源微粒和血小板源微粒可能誘導(dǎo)凝血酶形成，從而證實 ACS 發(fā)生急性血栓與紅細胞源、血小板微粒相關(guān)性[11～15]。

代謝組學(xué)是一個新的系統(tǒng)生物學(xué)方法，補充了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，是細胞系統(tǒng)中代謝物集合的綜合分析，已被用于發(fā)現(xiàn)疾病診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物，并揭示與疾病發(fā)病機制相關(guān)的機制[16]。結(jié)合代謝組學(xué)分析 ACS 的發(fā)病機制，為進一步研究血栓形成過程中微粒內(nèi)物質(zhì)變化提供新的窗口[17]。

本研究通過質(zhì)譜儀同時檢測ACS和非冠心病組正外周血物質(zhì)代謝和微粒內(nèi)物質(zhì)代謝，分析兩組外周血、微粒內(nèi)差異性物質(zhì)代謝物質(zhì)和代謝通路，同時證明 ACS 患者微粒內(nèi)代謝成份、代謝通路不同于外周血成分代謝。

對象與方法

1.樣本來源：所有納入對象均來自2016年9月～2017年2月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的患者。根據(jù)嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)最終從126例住院患者篩選出25例納入研究，所有患者入院時告知研究內(nèi)容并同時簽署知情同意書。研究對象分為ACS組(n=15)，其中男性10例，女性5例；高血壓病9例，糖尿病5例，吸煙5例，Non-CAD組(n=9)，其中男性5例，女性4例；高血壓病4例，糖尿病2例，吸煙3例，為了收集研究對象的一般資料和心血管疾病相關(guān)危險因素，制定了一份詳細的調(diào)查問卷。調(diào)查問卷主要包括一般個人信息、職業(yè)、家族歷史、吸煙狀況和飲酒。體格檢查包含血壓、心率、心電圖(ECG)、身高、體重、腰圍、腹部圍和臀圍測量，同時完善患者臨床相關(guān)生化指標(biāo)。

2.納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：所有入選患者均經(jīng)冠狀動脈造影證實冠狀動脈病變情況，冠狀動脈造影未見異常者視為非冠心病患者，納入非冠心病組。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：①不穩(wěn)定型心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn)是基于以前的研究：最近的1個月內(nèi)新發(fā)生的心絞痛,或1個月內(nèi)心絞痛惡化(心絞痛的分級增加了至少1級,或者達到3級,根據(jù)CCS評分,或在休息時出現(xiàn)心絞痛。心電圖顯示出至少兩個相鄰導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)新的或動態(tài)變化的ST段或T波,而肌鈣蛋白T(cTnT)的檢查結(jié)果是正常；②急性心肌梗死(AMI)為胸痛持續(xù)時間>20min，AMI患者的心電圖顯示海拔或抑郁的ST段,在24h內(nèi)至少兩個相鄰導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段的抬高或壓低，其抬高者為STEMI，未抬高者為Non-STEMI,同時cTnT>0.1μg/L(正常價值<0.05μg/L)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝腎功能不全；②腫瘤性疾??；③造血系統(tǒng)疾病；④類風(fēng)濕、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和干燥綜合征；⑤腦梗死和肺栓塞。

3.樣本收集：為避免冠狀動脈造影及相關(guān)介入治療影響外周血微粒的水平，所有患者均在冠狀動脈造影前進行外周血采集用來檢測代謝物質(zhì)。標(biāo)本為入院24h之內(nèi)患者的外周血，獲得知情同意書后，采集患者肘靜脈血2ml，血常規(guī)、血脂等檢測均在清晨空腹靜息狀態(tài)下抽取外周血送檢。用檸檬酸鈉抗凝管(美國BD公司)收集。在血液取樣時保證止血帶不應(yīng)該保持太長時間，從而避免誘導(dǎo)細胞的激活或凋亡。

4.一般項目和生化指標(biāo)：收集所有研究對象的一般資料，包括姓名、性別、年齡、吸煙(吸煙詳細記載吸煙年數(shù)，每天吸煙支數(shù))、飲酒；高血壓病、2型糖尿病、服藥史等。生化指標(biāo)包括總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerid，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein，HDL)、脂蛋白a、白蛋白、白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、血肌酐、心臟射血分?jǐn)?shù)(LVEF%)。

5.質(zhì)譜條件:UPLC質(zhì)譜串聯(lián)LTQ-Orbitrap velos (Thermo Fisher Scientific, SanJose, CA, USA)質(zhì)譜，采用電噴霧離子源正離子模式；鞘氣為氮氣和輔助氣，流速分別為45個任意單位 (arbitrary units) 和10個任意單位 (arbitrary units)；質(zhì)譜掃描范圍為100～1000m/z； 噴霧電壓設(shè)為4.2kV；離子傳輸管溫度350℃，數(shù)據(jù)采用高分辨傅里葉轉(zhuǎn)換模式(FT)獲取，一級分辨率為60000； 二級分辨率為15000；二級采用數(shù)據(jù)依賴(data-dependent)分析模式； 動態(tài)排除時間為15s；碎裂方式選擇HCD，相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：隔離寬度為3Da；碰撞能量：根據(jù)不同代謝物選擇20%、40%和60%； 啟動時間為30ms；

6.液相條件：采用Waters H-class 型號超高效液相色譜對樣品進行分離。分析條件如下：色譜柱：waters BEH C18 (3.0mm×100.0mm, 1.7μm),柱溫 50℃；流動相A 為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈。(1)外周血清分析梯度為：0～2min，2%B; 2～15min, 2%B～98%B; 15.0～15.1min, 98%B～100%B;15.1～25.0min, 100%B; 25.0～25.1min, 100%B～2%B; 25.1～30.0min，2%B；流速為0.3ml/min；進樣體積為5μl。(2)微粒分析梯度：0～2min，2%B; 2～15min, 2%B～98%B; 15.0～15.1min, 98%B～100% B; 15.1～25.0min, 100%B; 25.0～25.1min, 100%B～2%B; 25.1～30.0min，2%B；流速為0.3ml/min；進樣體積為5μl。

7.樣本制備：外周血標(biāo)本收集于帶有3.28%檸檬酸鈉(1∶9)的抗凝管，混勻后離心。(1)外周血標(biāo)本：在3500×g、室溫下離心10min離出血細胞，獲得血清，標(biāo)明收集日期以及患者入組編號于-80℃保存以便將來使用。血清在室溫下溶解，取樣 50μl， 加150μl 水，混勻，加400μl乙腈，混勻，4度靜置1h， 14000×g離心10min，取上清500μl, 離心濃縮，用200μl 2%乙腈水復(fù)溶，14000×g離心10min，取5μl進樣。(2)微粒：血標(biāo)本以3500×g、室溫下離心10min離出血細胞，其上清在20000×g15min 4℃離心獲得微粒標(biāo)本，微粒在室溫下溶解，放入-20℃冰箱冷卻30s，后放入37℃超聲清洗儀內(nèi)超聲打碎90s，加入200μl甲醇溶液，渦旋30s，超聲機2個循環(huán)，共20min以裂解微粒，放入4℃冰箱冷卻20min，14000×g10min 4℃離心，取上清，離心濃縮儀吹干(2～3h)，用20μl 2%乙腈水復(fù)溶，渦旋30s，37℃水浴30s，14000×g10min 4℃ 離心后進樣。

8.統(tǒng)計學(xué)方法：由UPLC-LTQ orbitrap 獲得的原始數(shù)據(jù)，采用美國Waters 公司的商業(yè)組學(xué)分析軟件progenesis QI (Version 2.0, Nonlinear Dynamics, UK)軟件進行處理。該軟件可自動完成峰對齊，峰識別和峰校正等前處理程序，最終輸出三維矩陣，即由保留時間和精確質(zhì)荷比組成的譜峰索引變量、樣本名稱和峰強度/面積組成。獲得的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入多變量統(tǒng)計軟件SIMCA-P software 14.0 (Umetrics AB, Umea, Sweden)進行PCA 分析，可視化組間變化趨勢。組間差異變量通過OPLS-DA模型獲取的VIP 值進行篩選，VIP值>1的變量認(rèn)為是組間顯著性差異變量。將鑒定得到的差異性變量進行代謝通路分析, 分析與疾病相關(guān)性較強的代謝通路。定量資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間采用t檢驗；不滿足參數(shù)檢驗條件的資料，以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)來表示，采用秩和檢驗。

結(jié) 果

1.ACS組和Non-CAD組臨床基本信息和臨床生化指標(biāo)資料:兩組患者在BMI、性別、是否合并糖尿病、是否合并高血壓病、是否吸煙方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明兩組間臨床基本信息具有可比性，兩組年齡比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 ACS組與Non-CAD組臨床基本信息的比較

ACS組和Non-CAD組臨床生化指標(biāo)情況:ACS組和Non-CAD組在外周血總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、脂蛋白a、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、血肌酐、白蛋白等方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，白細胞計數(shù)、心臟射血分?jǐn)?shù)(LVEF)兩組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明兩組間除白細胞計數(shù)和LVEF，其余臨床生化指標(biāo)具有可比性(表2)。提取微粒后使用電子顯微鏡證實微粒形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖1)。

2.外周血實驗結(jié)果:ACS組和Non-CAD組PCA趨勢分析：由圖2所見，ACS組和Non-CAD組具有顯著的代謝差異,質(zhì)控樣本重復(fù)性良好。

OPLS-DA模型及差異代謝物分析：采用OPLS-DA模型對變量進行聚類，篩選對聚類貢獻較大的變量。結(jié)果顯示，模型不存在過擬合，在可以接受的范圍內(nèi)。根據(jù)OPLS-DA模型，篩選對分類貢獻較大的變量(VIP>1.5，圖3,圖4)。

結(jié)合t檢驗得到兩組中具有顯著差異的變量，取交集得到差異變量81個(圖5)。對差異變量進行初步鑒定，根據(jù)精確分子量以及部分代謝物的二級碎片預(yù)測得到差異變量的候選代謝物，對代謝物進行通路分析，主要參與的代謝通路有磷脂代謝、鞘脂代謝、亞油酸代謝、酮體的合成與降解(圖6)。

3.微粒實驗結(jié)果：ACS組vs非冠心病組 PCA趨勢分析,PCA得分圖顯示，疾病組和正常組具有一定的代謝差異，質(zhì)控樣本重復(fù)性良好(圖7)。

表2 ACS組與Non-CAD組臨床生化指標(biāo)比較中位數(shù)(四分位數(shù)間距)]

圖1 ACS 外周血電子顯微鏡下微粒

圖2 PCA得分圖

OPLSDA模型及差異代謝物分析，采用OPLSDA模型對變量進行聚類，篩選對聚類貢獻較大的變量。結(jié)果顯示，模型不存在過擬合，在可以接受的范圍內(nèi)。根據(jù)OPLS-DA模型，篩選對分類貢獻較大的變量(VIP>1.5，圖8,圖9)

圖3 OPLS-DA得分圖和模型的置換檢驗

圖4 變量VIP 分布

圖5 結(jié)合VIP和t檢驗交集的差異變量

圖6 代謝物參與通路權(quán)重圖

圖7 PCA得分圖

結(jié)合t檢驗得到兩組中具有顯著差異的變量，取交集得到差異變量31個。對差異變量進行初步鑒定,根據(jù)精確分子量以及部分代謝物的二級碎片預(yù)測得到差異變量代謝物，主要參與的代謝通路有淀粉蔗糖代謝和戊糖、葡萄糖醛酸酶轉(zhuǎn)換(表3)。

討 論

據(jù)統(tǒng)計全球每年有上千萬人死于心血管疾病，其中一半以上死亡原因為急性心肌梗死，這就需要臨床能早期診斷和早期發(fā)現(xiàn)這類高危人群，進行早期臨床干預(yù)，降低這類疾病的發(fā)生率和病死率[18]。ACS的診斷基于臨床癥狀的評估、體表心電圖以及生物標(biāo)志物的綜合分析[19]。在缺乏典型的心電圖變化時，臨床上使用生物標(biāo)志物識別缺血癥狀對于ACS臨床診斷和危險分層至關(guān)重要。

圖8 OPLSDA得分圖和模型的置換檢驗

圖9 變量VIP 分布

化合物化合物 ID名稱化學(xué)式積分碎片分?jǐn)?shù)6.95_461.0566m/zHMDB596488-oxo-dGDPC10H15N5O11P238.08.617.35_833.4594m/zHMDB38350果膠糖苷C43H70O1434.722.007.64_310.0449m/zHMDB34043三氯氰菊酯C15H11O6+45.934.908.30_372.2714m/zHMDB1019911b-PGF2αC20H34O534.37.568.53_625.3404nHMDB02579糖昔脫氧膽酸3-葡糖苷酸C32H51NO1141.631.60

微粒不同于從凋亡細胞中釋放的直徑超過1μm的凋亡體，也不同于由細胞活化所釋放的直徑大約10.0～100.0nm的外泌體。目前研究證實微粒不僅僅是簡單的細胞膜脫落物，而且是攜帶其來源細胞的多種生物學(xué)信息，具有多種重要的生物活性分子的載體。近年來研究認(rèn)為微粒作為特定的外源凝集素和細胞因子的介質(zhì)，能促進細胞間的相互作用和細胞傳遞，被看作是細胞間信息傳遞的新路徑[20]。此外,微粒還攜帶有來源細胞的各種生物活性分子，如細胞因子、RNA和DNA，通過轉(zhuǎn)移這些生物活性分子致靶細胞，調(diào)節(jié)一系列生物效應(yīng)[21,22]?，F(xiàn)在越來越多的醫(yī)學(xué)證明，微?？勺鳛楹芏嘞到y(tǒng)疾病的診斷及治療的生物標(biāo)志物，包括心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤疾病[23]。微粒不僅能反映細胞的激活狀態(tài)，也能反映炎性進展和高凝狀態(tài)的特征。因此，微粒被公認(rèn)為許多凝血和炎性疾病的關(guān)鍵因素。

代謝水平的改變能更快地反映生理水平的改變，它能代表疾病表型。代謝組學(xué)允許多變量的定量測定，反應(yīng)代謝組學(xué)病理生理激活，沒有針對性的代謝組學(xué)方法主要涉及大量代謝物的客觀的分析，這種方法提供了更大范圍的代謝物，通常這是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)過程的初始階段，后來通過其他有針對性的分析方法得到進一步證實。

近年來對冠心病、急性心肌梗死的代謝組學(xué)研究引起了國內(nèi)外廣泛關(guān)注，事實證明血漿中的代謝物在疾病的預(yù)測、診斷、治療中起著重要的作用，有助于急性冠脈綜合征的早期發(fā)現(xiàn)，積極進行干預(yù)治療，并很大程度上降低心血管惡性事件的發(fā)生。Ali等發(fā)現(xiàn)STEMI、UA和正常組的外周血中共有68種代謝物，健康者與STEMI患者相比，其主要峰值差異為H2S、甘油、乳酸、尿酸和脂肪酸。另有研究發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定型心絞痛和AMI之間的代謝組學(xué)有明顯的差異，有變化的代謝物包括磷脂、脂肪酸、神經(jīng)鞘脂、甘油脂和類固醇，這些血清中鑒別性代謝物的發(fā)現(xiàn)對疾病發(fā)病機理的洞察提供了更多依據(jù)。Carlos等比較非ST段抬高ACS患者和健康對照的外周血漿，鑒定出兩組間有15種代謝產(chǎn)物具有差異，反映了心肌細胞遭受氧化應(yīng)激和缺氧狀態(tài)時動脈粥樣硬化過程的代謝組學(xué)特征，有助于更好的解釋心臟細胞中發(fā)生的變化。然而，對于急性心肌梗死患者外周血中微粒的代謝組學(xué)研究尚未見相關(guān)文獻報道。代謝物分析技術(shù)可以為疾病發(fā)生、發(fā)展過程提供一個詳細的代謝過程圖。因此，這將為發(fā)現(xiàn)預(yù)測生物標(biāo)志物從而更早的進行臨床治療的干預(yù)提供機會。

本研究外周血代謝組學(xué)結(jié)果顯示差異變量81個，對差異變量進行初步鑒定，根據(jù)精確分子量以及部分代謝物的二級碎片預(yù)測得到差異變量的候選代謝物，對代謝物進行通路分析，主要參與的代謝通路有磷脂代謝，鞘脂代謝，亞油酸代謝，酮體的合成與降解等。ACS患者的外周血微粒代謝物鑒定顯示無數(shù)種不同程度發(fā)生的代謝物，其主要的代謝途徑主要有淀粉蔗糖代謝和戊糖、葡萄糖醛酸酶轉(zhuǎn)換途徑的改變。

酮體水平升高是一個常見的代謝區(qū)域，也可能與能量代謝有關(guān)。脂肪酸氧化，在葡萄糖和脂質(zhì)代謝中的作用已經(jīng)明確。在饑餓或糖尿病的情況下，由于高水平的脂肪酸和低胰島素，酮體的水平顯著增加，在這種情況下，它們成為心肌的主要能量供應(yīng)。本研究結(jié)果提示缺氧情況“模擬”糖尿病發(fā)生的生理狀況，葡萄糖代謝的低能量產(chǎn)量迫使細胞使用脂肪作為能量來釋放酮體作為最終物質(zhì)。β-羥基丁酸酯和丙酮都是主要合成的酮體。

筆者認(rèn)為，這些代謝變化可能對MI患者的早期風(fēng)險分層有用，特別是當(dāng)患者入院時肌鈣蛋白結(jié)果為陰性，如ACS患者觀察到上述差異性代謝物和代謝途徑，能夠分配不同的相關(guān)代謝簇。筆者嘗試建立的特異性代謝預(yù)測生物標(biāo)志物預(yù)測心肌損傷，從而允許能早期干預(yù)和(或)尋找更顯著治療方法，這就需要開展更大的樣本量和多中心的隨機對照研究進一步證實。