張興華 姚曉莉 張 杰 秦 聰

CaMKⅡ是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內Ca2+信號轉導的重要介質，其活性通過鈣離子信號調節(jié)[1]。CaMKⅡ家族有4種不同基因表型(α、 β、γ、δ)，每一種基因編碼一種不同的CaMKⅡ亞型，最近研究表明CaMKⅡ各種亞型在胃癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中過表達，且與其臨床病理參數(shù)密切相關[2～4]。相關研究表明,CaMKⅡ活化包括離子通道、激酶、轉錄因子在內的約40種蛋白質從而在多種腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移調控中發(fā)揮重要作用，亦有研究表明CaMKⅡ通過調控腫瘤干細胞的生長及分化而在腫瘤復發(fā)、治療抵抗等發(fā)揮重要作用[5～8]。既往通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)CaMKⅡδ基因可能與前列腺癌侵襲、轉移密切相關[9]。本研究應用實時熒光定量PCR檢測13例前列腺癌患者的CaMKⅡδ的mRNA表達情況，以期驗證生物信息學分析的結果，同時應用免疫組織化學方法分析60例前列腺癌患者CaMKⅡδ蛋白的表達，并分析CaMKⅡδ蛋白表達與PSA、Gleason評分、前列腺癌病理分期、淋巴結轉移情況等臨床病理參數(shù)的相關性，探討CaMKⅡδ在前列腺癌組織中表達的意義。

材料與方法

1.材料： 選取2013年12月～2016年8月期間在武漢大學人民醫(yī)院泌尿外科進行前列腺癌根治術的手術切除標本60例，術前取得患者同意并簽署知情同意書。標本均經病理診斷證實，取癌組織及其癌旁組織標本。同期收集20例前列腺癌根治術后即刻組織樣品，從每個前列腺取兩個組織樣品，一個來自疑似癌變區(qū)，另一個來自鄰近疑似良性區(qū)。每個組織樣品的一半經石蠟切片HE染色后由病理專家確認取材準確性，而另一半立即儲存于液氮之后轉移到-70℃深低溫冰箱中保存，用于RNA提取。病理確診顯示13例患者如預期所示，一個樣品取自癌旁組織，另一個取自癌組織，5例患者兩個組織樣本均為癌組織，兩個樣品組織中均為癌旁組織。所以病例均為首次治療，排除接受過術前內分泌治療和放療及合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤的患者，患者平均年齡68.2±6.4歲。本實驗通過筆者醫(yī)院倫理委員會審核。

2.免疫組織化學檢測：用美國Thermo Scientific公司UltraVision Quanto Detection System HRP DAB二步法檢測CaMKⅡδ蛋白及β-catenin蛋白表達情況，CaMKⅡδ及β-catenin一抗購置英國Abcam公司， DAB 顯色鏡檢，蘇木素復染，中性樹膠封片、鏡檢、3D Histech數(shù)字切片掃描儀掃描拍照、結果判斷。免疫組化結果判定：CaMKⅡδ結果判斷采用半定量分析法，每張切片均經兩位病理專家獨立判斷，不一致切片，請第3位專家判斷[10]。染色評分:無著色為0分,淡黃色為1分,中度染色2分,強染色為3分。染色細胞計數(shù):無細胞染色為0分,≥1%且<10%為1分,≥10%且<25%為2分, ≥25%且<50%為3分，≥50%且<75%為4分,75%～100%為5分。將兩項結果相乘:0分為無表達,1～8分為弱表達,>8分為高表達。β-catenin蛋白表達分別評價染色強度和定位，然后根據(jù)染色強度分類為0～5分，≥4分為高表達，定位根據(jù)主要染色區(qū)域定位于胞核、胞質或膜染色[11]。

3.RT-PCR檢測：組織RNA的提取按Trizol 說明書進行操作,并檢測純度和濃度。使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(1602)進行反轉錄，按使用說明書操作。CaMKⅡδ及內參actin引物如下：CaMKⅡδ：上游引物:5′-AAGATGTGAAAGCACGAAAGCA-3′,下游引物:5′-TCCCTTCCACTAAATTACCCAAAG-3′;actin:上游引物:5′-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3′,下游引物:5′-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3′。Real-time PCR 反應條件：① 95℃，10min；②95℃,15s；③60℃,60s，②～③間共40個循環(huán)，溶解曲線：75℃→95℃，每20s升溫1℃。以actin作為內參，對目的基因進行均一化，反應結束后確認實時定量 PCR 的擴增曲線和融解曲線。每個樣本重復 3遍，數(shù)據(jù)分析采用 2-△△Ct法。ΔΔCt法：A=Ct(目的基因，待測樣本)-Ct(內標基因，待測樣本)，B=Ct(目的基因，對照樣本)-Ct(內標基因，對照樣本)，ΔΔCt=A-B，目的基因的相對表達量= 2-△△Ct。

4.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析, 兩組間差異比較采用t檢驗，陽性率比較采用χ2檢驗，相關分析應用Pearson′s相關分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.CaMKⅡδ mRNA在前列腺癌組織的表達：檢測了13例臨床前列腺癌組織及其癌旁組織中CaMKⅡδ mRNA表達，CaMKⅡδ mRNA在前列腺癌組織中表達顯著高于癌旁組織(P<0.01，圖1)，進一步分析發(fā)現(xiàn)伴淋巴結轉移的前列腺癌患者的CaMKⅡδ mRNA表達顯著高于不伴淋巴結轉移的患者(P<0.01，圖2)。

圖1 RT-PCR檢測前列腺癌組織及癌旁對照組織CaMKⅡδ mRNA表達情況

圖2 淋巴結轉移與無淋巴結轉移CaMKⅡδ mRNA表達情況

2.CaMKⅡδ 蛋白在前列腺癌組織的表達：免疫組化法檢測60例前列腺癌組織和對應的癌旁組織中CaMKⅡδ 蛋白的表達情況，CaMKⅡδ 表達定位于胞質(圖3)。通過免疫組化染色強度評分發(fā)現(xiàn)CaMKⅡδ 蛋白在43.3%(26/60)的前列腺癌組織過表達，而在癌旁對照組織過表達率僅為8.33%(5/60)。前列腺癌組織的CaMKⅡδ 蛋白表達顯著高于癌旁組織，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖4)。

圖3 免疫組化檢測前列腺癌組織及癌旁組織CaMKⅡδ 蛋白表達情況(×200)

圖4 CaMKⅡδ 蛋白在的前列腺癌組織中表達

3.CaMKⅡδ 在前列腺組織的表達的意義：分析CaMKⅡδ表達與前列腺癌血清PSA、Gleason評分、T分期、淋巴結轉移和病理分期等臨床病理參數(shù)的關系。CaMKⅡδ蛋白表達水平與前列腺癌臨床分期(P=0.006)、淋巴結轉移情況(P=0.030)及病理分期(P=0.005)顯著相關，與血清PSA水平(P=0.790)，Gleason評分(P=0.900)無顯著相關性(表1)，以上結果提示CaMKⅡδ 表達與前列腺癌外侵和轉移密切相關，CaMKⅡδ可能在前列腺癌轉移進程中發(fā)揮重要作用。

表1 CaMKⅡδ蛋白與人前列腺癌組織病理學參數(shù)之間的關系

4.CaMKⅡδ蛋白與β-catenin蛋白表達的相關性：首先應用HE染色確定相應前列腺癌組織區(qū)域，然后應用免疫組化法同時檢測了前述60例前列腺癌組織中β-catenin蛋白表達情況，β-catenin表達定位于胞膜、胞質或胞核中。β-catenin 蛋白在38.3%(23/60)的前列腺癌組織高表達， CaMKⅡδ蛋白表達與β-catenin蛋白存在一致性(圖5)。相關分析發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中，CaMKⅡδ蛋白表達與β-catenin蛋白表達存在顯著相關性(r=0.80，P=0.000,圖6)。

圖5 兩例患者同部位CaMKⅡδ與β-catenin蛋白表達情況(×200)

圖6 前列腺癌組織切片CaMKⅡδ與β-catenin蛋白表達情況的相關性分析

討 論

CaMKⅡ是一個多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內Ca2+信號轉導的重要介質，其活性通過鈣離子信號調節(jié)，影響多種細胞的分化、發(fā)育及功能[12～14]。既往研究表明CaMKⅡ在胃癌、肝癌等多種癌組織中過表達，與多種腫瘤的分化程度、病理分級、病理分期、淋巴結轉移及預后明顯相關，但CaMKⅡδ在前列腺癌組織中的表達及其意義未見報道[2, 3]。Chi等[4]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中CaMKⅡ蛋白表達及T286磷酸化顯著高于癌旁正常組織，且淋巴結轉移的乳腺癌組織表達更高， CaMKⅡ表達和T286磷酸化增加提示乳腺癌患者中較差的總生存和無遠處轉移生存，有利于預測患者預后和轉移可能性。本研究結果亦顯示CaMKⅡδ mRNA和蛋白在病理分期晚的前列腺癌組織中顯著高于早期局限性前列腺癌，且與癌旁組織比較，前列腺癌組織中 CaMKⅡδ蛋白顯著過表達，CaMKⅡδ過表達與前列腺癌包膜外侵犯，淋巴結轉移顯著相關，而前列腺癌外侵及淋巴結轉移與前列腺癌的不良預后密切相關，提示CaMKⅡδ過表達與前列腺癌進展、轉移密切相關，CaMKⅡδ過表達可能是前列腺癌的不良預后因子。

既往研究顯示,CaMKⅡ通過Wnt/β-catenin信號通路調節(jié)惡性腫瘤的增殖及分化，并與腫瘤干細胞干性密切相關[8, 15]。Wnt/β-catenin通路與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移、去勢抵抗密切相關，但前列腺癌中，CaMKⅡδ是否通過Wnt/β-catenin信號通路調節(jié)腫瘤轉移進展尚未見報道[15,17]。

CaMKⅡ促進惡性腫瘤進展和轉移的具體分子機制尚不明了，Chai等[8]發(fā)現(xiàn)CaMKⅡγ通過激活NF-κB通路促進非小細胞肺癌細胞增殖，Mamaeva等[18]發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ通過激活Notch-1信號通路促進列腺癌細胞增殖和侵襲，Si等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡγ通過Wnt/β-catenin通路促進白血病細胞增殖并維持白血病干細胞特征，但CaMKⅡδ促進前列腺癌轉移的分子機制未見相關研究報道。Wnt/β-catenin通路參與多種發(fā)育過程，并與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移、雄激素抵抗等密切相關。多篇文獻報道β-catenin在前列腺癌中表達和定位發(fā)生改變，β-catenin在前列腺癌發(fā)展、轉移中發(fā)揮重要作用，與前列腺癌患者的轉移、預后密切相關[19]。一方面β-catenin定位于細胞膜與細胞表面E-cadherin形成復合物維持細胞間連接，細胞膜表面β-catenin/ E-cadherin復合物的丟失通過細胞-細胞黏附的喪失與前列腺癌進展和轉移密切相關[20]。另一方面β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路核心分子，Wnt/β-catenin信號通路激活導致β-catenin降解減少并進入細胞核激活轉錄因子TCF/LEF1和AR，引起靶基因例如C-myc、MMP7、Cyclin-D1和 AR等過表達促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展[16]。本研究檢測了60例前列腺癌標本同一部位CaMKⅡδ與β-catenin的表達，結果表明二者表達存在顯著相關性，筆者推測CaMKⅡδ可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進前列腺癌侵襲與轉移。

本研究證實CaMKⅡδ在前列腺癌組織中過表達，且與前列腺癌包膜外侵襲及淋巴結轉移密切相關，驗證了生物信息學分析的結果，CaMKⅡδ蛋白與β-catenin蛋白表達正相關，CaMKⅡδ可能通過Wnt/β-catenin促進前列腺癌侵襲轉移，但CaMKⅡδ在前列腺癌中的作用機制仍不清楚，有待于進一步研究。