夏德萌 羅廷澤 汪 洋 張洪躍 吳江紅 許碩貴 周潘宇

出血是創(chuàng)傷患者的主要臨床表現(xiàn)之一，而難以控制的出血是平時(shí)和戰(zhàn)時(shí)院前創(chuàng)傷死亡的主要原因[1]。美軍根據(jù)歷年戰(zhàn)術(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)戰(zhàn)場(chǎng)上因出血而死亡的傷員約占91.0%，因此將出血列為戰(zhàn)場(chǎng)三大可預(yù)防性死因之一[2,3]。平時(shí)各類(lèi)意外事故、突發(fā)災(zāi)難中，出血過(guò)多同樣是導(dǎo)致現(xiàn)代社會(huì)中人員死亡的主要原因之一[4]。為降低因出血而造成的致死率，各國(guó)醫(yī)學(xué)界對(duì)止血材料的止血性能要求日益提高。

殼聚糖(chitosan)作為一種具有很大發(fā)展?jié)摿Φ尼t(yī)用止血愈傷材料，是唯一自然存在的堿性多糖，是幾丁質(zhì)(甲殼素)經(jīng)脫乙酰作用的產(chǎn)物[5]。其具有良好的生物相容性和可降解性，可以促進(jìn)凝血和血栓的形成，同時(shí)還具有抑制多種細(xì)菌生長(zhǎng)和促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)[6,7]。由于該材料易于加工成型，適合作為敷料使用，Rall等[8]以殼聚糖為原料的止血敷料已通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證，并在伊拉克戰(zhàn)場(chǎng)上配備美軍。但是，由于殼聚糖溶于酸性環(huán)境中而難溶于水，純殼聚糖膜敷料存在吸水和抗水性能差的缺點(diǎn)，在pH值中性環(huán)境下，血液中80%以上都是水分，因此各種對(duì)殼聚糖親水性的改變是提高止血效果的關(guān)鍵，也是新一代止血材料的研究熱點(diǎn)[9]。

介孔二氧化硅(mesoporous silica nanoparticle, MSN)，是一種具有介孔和熱穩(wěn)定性的新型材料，其孔徑為5～22nm，同時(shí)具有較大孔容、高比表面積、孔徑可調(diào)范圍較廣且球形孔道之間通過(guò)窗口聯(lián)結(jié),因此具有優(yōu)良的傳質(zhì)性能[10]。本研究探索以MSN為內(nèi)核，殼聚糖為外殼，通過(guò)相轉(zhuǎn)移和分子印跡原理，制備具有吸水性MSN內(nèi)核和大孔殼聚糖外殼的復(fù)合止血?jiǎng)?duì)復(fù)合材料的微觀表征、生物相容性和止血性能進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

材料與方法

1.材料:殼聚糖(脫乙酰度90.5%，相對(duì)分子質(zhì)量400kDa，上?？ú┕べQ(mào)有限公司)，鹽酸、1,3,5-三甲苯(TMB)、正硅酸乙酯(TEOS)、氟化銨(NH4F)(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，冰乙酸(上海天蓮精細(xì)化工有限公司)，3-縮水甘油醚三甲氧基硅烷(GPTMS)、Pluronic P-123 (德國(guó)Sigma公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)。

2.儀器:D/max2550VB/PC型轉(zhuǎn)靶X射線多晶衍射儀(日本 Rigaku 公司)，F(xiàn)reezone 6型冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco公司)。

3.制備方法:(1)介孔二氧化硅(MSN)的制備:取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的濃鹽酸10ml與超純水65ml加入反應(yīng)容器40℃ 水浴，混合均勻后緩慢加入4g Pluronic (P123)并劇烈攪拌,持續(xù)時(shí)間約1h，至其完全溶解，溶液呈澄清狀態(tài)。加入4g 1,3,5-三甲苯(TMB)，在40℃水中浴攪拌約2h，逐滴加入9.2ml正硅酸乙酯(TEOS)并強(qiáng)烈攪拌，待全部加完后再繼續(xù)攪拌5min，將攪拌后的體系在40℃ 水浴中陳化20h，加入46mg氟化銨(NH4F)，輕微攪拌至其溶解，除去離心瓶中的上層清液，將剩余產(chǎn)物放入高壓反應(yīng)釜，在100℃ 恒溫箱中保持恒溫24h。待水熱反應(yīng)完畢后，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行離心(8000r/min，10min)，再經(jīng)水洗、醇洗各兩遍，在60℃ 恒溫箱烘干，最后用馬沸爐900℃ 煅燒烘干后的產(chǎn)物6h，得到白色粉末介孔二氧化硅(MSN)。(2)殼聚糖-介孔二氧化硅復(fù)合材料的制備:首先配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 的冰醋酸水溶液，再配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% 的殼聚糖-醋酸溶液，將殼聚糖-醋酸溶液20ml與3-縮水甘油醚三甲氧基硅烷(GPTMS)0.5ml在塑料瓶中進(jìn)行混合并攪拌2h后置于冰箱中過(guò)夜，得到chitosan-GPTMS，將上述制備的MSN取0.1g加入過(guò)夜的液體中，室溫?cái)?～8h，離心(8000r/min，10min)，再使用超純水沖洗2遍，最后置于凍干機(jī)中凍干，得到制備后殼聚糖-介孔二氧化硅復(fù)合材料(chitosan-MSN)。

4.材料表征測(cè)定:(1)氮?dú)馕?脫附曲線表征測(cè)定:采用全自動(dòng)物理吸附儀測(cè)定MSN的比表面積，設(shè)定液氮溫度 77.4K(-273.15℃=0K)。使用Brunauer-Emmett-Teller(BET)法計(jì)算材料的比表面積，Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法計(jì)算材料的孔容和孔徑。為去除物理吸附的水分，樣品在 573K、(0.2～1.0)kPa條件下活化處理4h，并通過(guò)靜態(tài)法測(cè)量吸附-脫附等溫曲線。(2)粒徑表征:使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS，Malven Autosizer 4700)測(cè)定納米粒子在去離子水中的流體力學(xué)直徑以及評(píng)價(jià)其在水中的穩(wěn)定性。散射角度為900，激光光源功率為150W，激光波長(zhǎng)為532nm。配制濃度大約為0.1mg/ml的納米粒子分散液，放置于PS樣品池中，溫度控制在25℃，穩(wěn)定5min后進(jìn)行測(cè)量。設(shè)定分散劑水的折射率為1.332，黏度為0.89Pa·S。采用ZETA Size 3000HS型Zeta電位測(cè)試儀(Malvern Instruments Ltd., UK)對(duì)材料的表面電荷進(jìn)行測(cè)定。

5.細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)：采用MTT方法評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞毒性。細(xì)胞株采用小鼠成肌細(xì)胞(C2C12，ATCC)，細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS(fetal bovine serum，GIBCO)，1%雙抗(100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素， GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中。首先消化細(xì)胞收集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行計(jì)數(shù)，使細(xì)胞懸液的濃度約5×104個(gè)/毫升，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μl，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天。將3種材料(MSN、chitosan、chitosan-MSN)加入培養(yǎng)基，配成1mg/ml濃度，浸泡1天。分別取100μl培養(yǎng)基浸提液，加入接種細(xì)胞的96孔板中，每孔100μl，替換原來(lái)的上清培養(yǎng)基，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 1、4和7天。每孔加入 10μl的MTT 溶液 (5mg/ml)，置入培養(yǎng)箱中 37℃ 下繼續(xù)培養(yǎng)4h；吸棄培養(yǎng)基浸提液并加入 DSMO (150微升/孔)，在室溫下震蕩10min；采用酶標(biāo)儀以 570nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A值)。細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)根據(jù)下式計(jì)算相對(duì)增殖率(relative growth rate, RGR)。RGR(%)=A(實(shí)驗(yàn)組)-A(空白組)/A(陰性對(duì)照組)-A(空白組) ×100%。

6.吸水性能評(píng)價(jià):采用比重法測(cè)試材料吸水性能。使用模擬體液(SBF)液體進(jìn)行測(cè)試，首先通過(guò)電子分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取試劑配制成 1L溶液并調(diào)節(jié) pH值至7.25，置于37℃ 下備用。實(shí)驗(yàn)前，樣品均經(jīng)過(guò)120℃ 真空干燥過(guò)夜，以充分去除材料的吸收水分。計(jì)算吸水率，采用標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)用紗布作為對(duì)照。方法如下：稱(chēng)量樣品重量標(biāo)記為Wwet，將其置于放有濾紙的漏斗中，逐滴緩慢加入SBF溶液，置于第1滴液體從漏斗中滴出。再次稱(chēng)量樣品標(biāo)記為Wdry。采用公式：[(Wwet-Wdry)/Wdry]×100%計(jì)算出樣品的吸水率，其中Wdry表示干燥樣品質(zhì)量,Wwet表示吸附SBF 溶液之后的樣品質(zhì)量，每組樣品測(cè)3次。

7.體外凝血實(shí)驗(yàn):通過(guò)凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)的測(cè)定評(píng)價(jià)材料的體外凝血性能。取健康成年新西蘭大白兔血液，首先用3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑進(jìn)行抗凝處理，然后高速離心(2500×g, 37℃)，離心15min，得到貧血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)。PT測(cè)試步驟如下：50μl PPP和100μl PT試劑分別在37℃下恒溫5min，然后一同加入PT 測(cè)試管中，加入待測(cè)樣品。APTT測(cè)試步驟如下：先將50μl APTT 試劑加入到50μl PPP中，并在37℃下恒溫 5min，然后加入50μl濃度為0.025mol/L的CaCl2溶液以及待測(cè)樣品，并放入APTT 測(cè)試管中，分別通過(guò)法國(guó)生物梅里埃公司血凝分析儀(HF6000，Biomerieux，F(xiàn)rance)測(cè)試PT和APTT，進(jìn)行測(cè)試每個(gè)樣品重復(fù)3次。

7.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證:通過(guò)建立肝創(chuàng)傷出血模型來(lái)評(píng)價(jià)樣品的體外止血性能。取健康成年新西蘭大白兔18只，隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組(不使用任何止血?jiǎng)?、chitosan組(使用chitosan止血?jiǎng)?、chitosan-MSN組(使用chitosan-MSN止血?jiǎng)?，每組6只。采用靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，制造肝創(chuàng)傷模型，大致方法如下：術(shù)區(qū)備皮后，消毒鋪單，逐層開(kāi)腹，直至暴露肝臟組織，在肝臟左葉用手術(shù)刀做2cm×2cm“十”字型切口，深約0.5cm，形成臟器滲血?jiǎng)?chuàng)面。任其自由出血10s后，用醫(yī)用紗布吸干血液，迅速平鋪止血材料，通過(guò)秒表記錄止血時(shí)間。

結(jié) 果

1.氮?dú)馕?脫附表征測(cè)定:介孔二氧化硅具有較大的比表面積、孔容量以及均勻的孔道分布等特性，為進(jìn)一步驗(yàn)證，將制備的樣品進(jìn)行N2吸附-脫附實(shí)驗(yàn)。使用Brunauer-Emmett-Teller(BET)法計(jì)算材料的比表面積，Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法計(jì)算材料的孔容和孔徑，測(cè)定MSN的比表面積為524m2/g，孔容為1.2m3/g，孔徑為3.5nm。

2.粒徑和電荷測(cè)定:表1為MSN、Chi-MSN的Zeta電位值。從表中可以看出，MSN材料粒子粒徑為153nm，Zeta電位為負(fù)值-18.5mV。而MSN粒子與殼聚糖復(fù)合改性后，粒徑為221nm，Zeta電位值變?yōu)檎?.43mV。

表1 MSN和chitosan-MSN的粒徑和電荷

3.細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)結(jié)果:MTT法通過(guò)檢測(cè)材料的浸提液對(duì)細(xì)胞的毒性，可以敏感地從體外評(píng)價(jià)材料的毒性。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)比了MSN、chitosan、chitosan-MSN 3種材料的毒性，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠成肌細(xì)胞1天內(nèi)就開(kāi)始貼壁，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，4天后細(xì)胞密度增大并持續(xù)到7天，材料在培養(yǎng)液中沉于孔板底面，其附近或邊緣均長(zhǎng)滿小鼠成肌細(xì)胞。chitosan組、MSN組、chitosan-MSN組的細(xì)胞存活率均>90%(圖1)。

圖1 chitosan、MSN、chitosan-MSN 3種材料的細(xì)胞存活率

4.吸水性能評(píng)價(jià)結(jié)果：對(duì)3種材料吸水率的測(cè)定，chitosan的吸水率只有118%，而MSN孔徑大，吸水性強(qiáng)，到達(dá)295%。而MSN改進(jìn)后的chitosan吸水率達(dá)到281%(圖2)。

圖2 chitosan、MSN、chitosan-MSN 3種材料吸水率

5.APTT和PT測(cè)定結(jié)果：3種材料的PT均沒(méi)有顯著影響(圖3)，但3種材料的APTT都有所下降。同時(shí)通過(guò)對(duì)3種材料間的對(duì)比，MSN和chitosan都有止血作用，與空白對(duì)照組比較，分別下降了18%和27%，而通過(guò)MSN修飾后的復(fù)合材料，止血效果有了顯著的提高，APTT下降了56%，進(jìn)一步證明了復(fù)合的chitosan-MSN有著更好的止血效果。

圖3 chitosan、MSN、chitosan-MSN 3種材料活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)相對(duì)于空白對(duì)照組的比率

6.肝創(chuàng)傷出血模型止血性能評(píng)價(jià)：本實(shí)驗(yàn)采用兔

的肝臟創(chuàng)傷出血模型，制造相對(duì)恒定的出血?jiǎng)?chuàng)面。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用chitosan、chitosan-MSN兩種止血?jiǎng)?，和不加任何止血?jiǎng)?，只用紗布止血進(jìn)行對(duì)比，測(cè)量動(dòng)物的出血量和出血時(shí)間。由圖4可見(jiàn)，chitosan-MSN材料覆蓋于出血的“十”字型創(chuàng)口上，并成功止血，同時(shí)也能很好地黏附于組織，不易脫落，有助于止血。在對(duì)止血時(shí)間的記錄上，相較于紗布止血的對(duì)照組，chitosan和chitosan-MSN都顯示出較好的止血效果，止血時(shí)間明顯縮短(圖5)。但chitosan-MSN組的止血時(shí)間比chitosan組更短。

圖4 chitosan-MSN復(fù)合材料在肝創(chuàng)傷模型中的止血過(guò)程圖

圖5 3組止血時(shí)間

討 論

殼聚糖(chitosan)作為一種具有多種功能的生物材料，具有較好的凝血特性，同時(shí)有著無(wú)毒、無(wú)抗原性等優(yōu)點(diǎn)，以止血迅速而運(yùn)用于軍事行動(dòng)和外科手術(shù)止血中。但其親水和吸水性能較差，對(duì)人體有一定的微刺激性，同時(shí)單純的殼聚糖止血效果有限，難以適用于實(shí)質(zhì)臟器的大面積創(chuàng)傷的廣泛出血[12]。近年來(lái)，介于微孔和大孔材料之間的介孔材料的發(fā)展，給解決這些問(wèn)題提供新的思路。其有著孔容較大、比表面積較高、孔道結(jié)構(gòu)有序且可調(diào)的特點(diǎn)，同時(shí)可在其孔道或表面進(jìn)行物理吸附或化學(xué)修飾，固定功能分子等優(yōu)勢(shì)[13]。本身同樣有著止血作用的介孔二氧化硅可以對(duì)殼聚糖的止血性能進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)和完善，本實(shí)驗(yàn)預(yù)先制備出介孔二氧化硅(MSN)，再通過(guò)相轉(zhuǎn)移和分子印跡原理，用MSN對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性和修飾，以期提高止血性能。

止血是指停止受損血管出血的過(guò)程，并且是在幾個(gè)連續(xù)階段中進(jìn)行的，包括血管的收縮，凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活和血凝塊的形成。因此，加速上述任何階段的止血?jiǎng)┒伎梢杂兄趯?shí)現(xiàn)理想的止血[14]。殼聚糖通過(guò)自身所具有的聚陽(yáng)離子特性，誘導(dǎo)紅細(xì)胞的黏附和聚集，同時(shí)促進(jìn)血小板的活化和凝集，以及激活補(bǔ)體系統(tǒng)，最終形成血凝塊，起到止血的作用[15]。在此基礎(chǔ)上，筆者將介孔二氧化硅引入，作為一種納米級(jí)的二氧化硅，已有研究表明，納米級(jí)的二氧化硅能與血液中的凝血因子FⅫ直接作用，激活FⅫ，且二氧化硅的粒徑越小，激活作用越強(qiáng)[16]。FⅫ作為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)因子，其活化的加速有助于凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的加速，促進(jìn)止血，本研究中APTT時(shí)間在MSN組的減少也進(jìn)一步證明這一機(jī)制。同時(shí)MSN可以利用其較大孔容、高比表面積、三維孔隙系統(tǒng)等優(yōu)勢(shì)，吸收血液和組織中的水分，從而起到凝血因子和血小板濃縮的作用[17]。有助于殼聚糖更好地促進(jìn)血小板的活化與聚集，克服其不適用于實(shí)質(zhì)臟器創(chuàng)傷廣泛出血的缺陷。本研究中，chitosan-MSN復(fù)合材料，在肝臟創(chuàng)傷出血模型中的作用也證明了改材料的止血性能。同時(shí)有研究認(rèn)為，止血材料快速凝血作用導(dǎo)致血液在材料表面迅速凝結(jié)并堵塞材料的多孔結(jié)構(gòu)，從而阻礙材料的進(jìn)一步吸收液體的作用，這也是導(dǎo)致止血材料不能充分發(fā)揮作用的關(guān)鍵，本研究探索MSN為內(nèi)核，殼聚糖為外殼，制備具有吸水性MSN內(nèi)核和大孔殼聚糖外殼的材料，克服了這一弊端，有助于提高止血性能[18]。

理想的止血材料不僅要有很好的止血性能，而且要兼具好的生物相容性和安全性。本研究中，通過(guò)MTT法對(duì)材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，根據(jù)結(jié)果本研究發(fā)現(xiàn)chitosan-MSN組處理細(xì)胞1、4和7天后的細(xì)胞存活率均要高于90%，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步驗(yàn)證了該復(fù)合材料良好的生物相容性。因?yàn)閺?fù)合材料有通過(guò)吸附血液中的水份來(lái)起到止血作用這一機(jī)制，因此安全性同樣不可忽略。沸石止血?jiǎng)?quickclot)，這樣一種通過(guò)FDA認(rèn)證并被投入使用的止血?jiǎng)?，已?jīng)被證明在控制創(chuàng)傷性大出血有著出色的效果[19]。其具有較大的比表面積，可以從血液中選擇性快速吸附大量水以促進(jìn)凝血因子和血小板的濃縮與凝結(jié)，但在吸附水的同時(shí)，釋放大量的熱，易造成使傷員感到疼痛和創(chuàng)面的灼傷，現(xiàn)已不推薦在戰(zhàn)場(chǎng)使用[20]。本研究中采用的MSN材料，已被證明有著良好的水熱穩(wěn)定性，不會(huì)造成創(chuàng)面的灼傷，是一種安全的止血材料。

綜上所述，殼聚糖-介孔二氧化硅復(fù)合材料有著良好的止血性能、生物相容性和安全性，有著一定的應(yīng)用前景，但其涉及的凝血機(jī)制可能是多個(gè)材料參與的多條凝血途徑，有待于進(jìn)一步探索研究。