郭天聰，寧 欣，倪 楠，孟曉丹，邊明艷，薛運昕

(遼寧省金秋醫(yī)院呼吸內科，沈陽 110000)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種進展性的復雜心血管系統(tǒng)疾病，其血流動力學診斷標準為：海平面靜息狀態(tài)下，右心導管檢測肺動脈平均壓(mean pulmonary artery pressure,PAP)≥25 mm Hg。PAH是常見病、多發(fā)病，為肺動脈壓力升高并且超過一定界值的血流動力學和病理生理狀態(tài)，可導致右心心力衰竭，臨床上PAH可以是一種獨立的疾病，也可以是并發(fā)癥或是綜合征[1]。隨著新治療方法的不斷出現(xiàn)，PAH仍是一種病死率較高的疾病，病死率約為5.5/10萬人[2]，因此，仍需要對其進行深入的研究。miRNA(miR)是一類長19～25 NT的非編碼小RNA，通過抑制翻譯或降解mRNA轉錄本的方式，從轉錄及轉錄后水平調控靶基因的表達[3]。miR參與調節(jié)細胞的多種生物學功能，包括增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲及細胞周期[4]。然而，miR在心血管疾病中的研究較少。因此，本研究擬從miR的角度探索PAH的發(fā)生、發(fā)展，以期為PAH的診斷及治療帶來新的幫助，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月至2018年2月本院初診的30例PAH患者為試驗組，患者未經(jīng)任何降壓治療，除外其他基礎疾病。納入標準:診斷嚴格遵守尼斯2013版PAH診療標準[5]，且經(jīng)過動脈導管測量確診，同時根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標準[6]對患者進行功能分級，其中1級7例，2級16例，3級6例，4級1例。排除標準:(1)心肌梗死、肝腎功能不全、左心心力衰竭、肺栓塞、自身免疫性疾病、腫瘤、近期手術；(2)近期感染；(3)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)<70 mg/L；(4)妊娠或哺乳期。30例患者中男13例，女17例，中位年齡29歲。選取同期本院健康體檢者30例作為對照組，其中男16例，女14例，中位年齡31歲。兩組對象性別、中位年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人肺動脈平滑肌細胞(HPVSMC)購自上海富衡生物，人胚腎細胞株HEK293購自上海生科院，常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素及100 IU/mL青霉素)，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件下進行培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2熒光素酶報告基因檢測 HEK293細胞應用miR-182 mimics及肌細胞增強因子2C(MEF2C) 3′UTR熒光素酶載體共轉染，以NC及空載體為對照，轉染24 h后進行熒光素酶檢測，參照Promega公司熒光素酶檢測系統(tǒng)。mimics由上海吉瑪公司合成，MEF2C 3′UTR熒光素酶載體由賽業(yè)生物構建。

1.2.3實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測 PAH患者入院后于第1次治療前采集外周血標本，并收集同期健康體檢者外周血標本，采血2～3 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，外周血標本采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，并加Trizol 1 mL于EP管中于-20 ℃冰箱保存。標本收集完成后，采用Trizol-氯仿方法提取細胞總RNA，于-20 ℃冰箱臨時保存，隨后采用Oligo dT法及特異性引物法進行反轉錄，以管家基因U6為內參，同時進行miR-182、MEF2C及U6的RT-PCR。反應體系如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，35個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。RT-PCR反應設置3個復孔，得出Ct均值，以健康者為對照，應用△△Ct相對定量法分析miR-182及MEF2C表達水平的差異?！鳌鰿t=△Ct試驗組-△Ct對照組，△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因，2-△△Ct即為基因表達差異的倍數(shù)。引物序列，MEF2C正向：TCT GTC TGG CTT CAA CAC TG；反向:TGG TGG TAC GGT CTC TAG GA。miR-182正向1：GTT GGC TCT GGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CCA GAG CCA ACA GTG TGA G；正向2：CGG CGG TTT GGC AAT GGT AGA ACT；反向2：GTG CAG GGT CCG AGG T。U6正向：CTC GCT TCG GCA GCA CA；反向：AAC GAT TCA CGA ATT TGC GT。

1.2.4Western blot檢測 單去污裂解液提取HPVSMC總蛋白，以考馬斯亮藍法進行定量。將煮沸變性后蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，并低溫轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室溫封閉膜后與MEF2C抗體(1∶1 000)和GAPDH內參抗體(1∶5 000)進行一抗孵育過夜，相應的辣根過氧化物酶標記二抗孵育(1∶5 000)1 h，最后以ECL發(fā)光法檢測條帶。

1.2.5細胞增殖能力檢測 采用DOJINDO細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測細胞增殖能力，于轉染第0～4天分別進行檢測，操作嚴格遵守說明書進行，并在多功能酶標分析儀MB580檢測波長為450 nm的OD值。細胞活力%=(試驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。細胞檢測時間設為5個時間點：0、1、2、3、4 d，其中0 d設為轉染后6 h。細胞計數(shù)2 000個并鋪板，鋪板6 h后進行轉染，每48 h進行細胞換液。

2 結 果

2.1miR-182與MEF2C的3′UTR靶向調控關系驗證 根據(jù)生物信息學預測(targetscan)，發(fā)現(xiàn)miR-182可以靶向結合于MEF2C的3′UTR區(qū)，見圖1A。熒光素酶報告基因結果顯示，wtMEF2C與miR-182 mimics共轉染，熒光素酶活性降低(t=6.042,P=0.004)，而mutMEF2C與miR-182共轉染，熒光素酶活性并無顯著降低(P=0.563)，見圖1B。

A：miR-182靶向結合MEF2C的3′-UTR區(qū)示意圖及突變型載體；B：wtMEF2C、mutMEF2C、miR-182共轉染HEK293細胞24 h后熒光素酶活性檢測柱狀圖；a:P<0.05，與wtMEF2C比較

圖1 miR-182靶向結合于MEF2C的3′-UTR區(qū)

2.2兩組miR-182及MEF2C相對表達水平比較 與對照組比較，試驗組miR-182表達升高(t=5.216,P=0.006)，而MEF2C表達降低(t=3.128,P=0.035)，見圖2。

A：miR-182相對表達水平；B：MEF2C相對表達水平；a：P<0.05，與對照組比較

圖2兩組miR-182及MEF2C相對表達水平比較

2.3miR-182對MEF2C蛋白的調控 與對照組比較，轉染miR-182抑制劑后，HPVSMC中MEF2C蛋白表達顯著增高(t=3.526,P=0.024)，見圖3。

A：HPVSMC中轉染miR-182抑制劑后MEF2C蛋白檢測；B：MEF2C及GAPDH灰度值分析柱狀圖；a：P<0.05，與對照組比較

圖3 miR-182對MEF2C蛋白的調控

A：轉染miR-182抑制劑后HPVSMC的增殖曲線；a：P<0.05，與對照組比較

圖4 miR-182對HPVSMC的增殖影響

2.4miR-182對HPVSMC細胞增殖能力的影響 與對照組比較，在HPVSMC中轉染miR-182抑制劑后，發(fā)現(xiàn)HPVSMC的增殖能力降低，采用重復測量T檢驗發(fā)現(xiàn)，miR-182抑制劑對HPVSMC細胞增殖抑制作用具有時間依賴性(P=0.019)，提示miR-182促進HPVSMC的細胞增殖。其中抑制率在第3天及第4天即達到顯著差異(P=0.005,0.027)，見圖4。

3 討 論

PAH是一種多因素疾病，遺傳學、表觀遺傳學及環(huán)境均可導致PAH的發(fā)生。近年來，越來越多的miR被發(fā)現(xiàn)參與PAH的發(fā)病，COURBOULIN等[7]在PAH患者和健康對照者的肺組織標本中比對了337個miR，發(fā)現(xiàn)有6種miR存在上調，而只有1種miR存在下調。隨之，RHODES等[8]通過對PAH患者和健康對照者的血漿標本進行芯片篩查，發(fā)現(xiàn)有58種miR存在異常表達，其中miR-150降低最為顯著，且對于PAH患者有著更差的預后。此外，研究者發(fā)現(xiàn)還有更多的miR在PAH患者中存在異常表達，但是迄今為止，僅有數(shù)種miR被通過實驗證明確實在PAH的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定的作用，包括miR-17-92、miR-143/145、miR-21和miR-124等[9-13]。

miR-182通常被認為是原癌基因在腫瘤的高表達，并促進腫瘤細胞增殖，例如miR-182在乳腺癌中高表達，并且通過靶向叉頭蛋白F2(FOXF2)促進腫瘤細胞增殖和遷移[14]。miR-182在結腸癌中高表達，并且通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路維持腫瘤細胞的干細胞狀態(tài)[15]，miR-182在膠質瘤中高表達，并且通過靶向果糖-2,6-二磷酸酶2(PFKFB2)提高腫瘤細胞增殖及侵襲能力[16]。本研究首次通過PCR方法發(fā)現(xiàn)miR-182在PAH患者中存在顯著上調，推測其可能在PAH的發(fā)生、發(fā)展中起到某種作用。而關于miR-182在非腫瘤性疾病中研究較少，有研究證明其在腦梗死患者存在高表達，且預示著較高的復發(fā)率，因此需要進一步來研究miR-182在PAH的作用機制。另外，miR-182在PAH患者血漿中存在高表達，提示其作為PAH診斷靶點的可能性，目前右心導管檢查是PAH診斷的金標準，但作為有創(chuàng)性檢查較大地限制了其應用。MEF2C通常被認為參與HPVSMC增殖及分化[17]，重建其高表達會抑制肺動脈內皮細胞的增殖，進而緩解PAH癥狀[18]。而miR-182可通過下調MEF2C促進HPVSMC的增殖，并通過CCK-8實驗驗證了這一現(xiàn)象。有研究通過小鼠實驗表明miR-182可通過靶向MYADM重塑HPVSMC表型來延緩動脈粥樣硬化[19]，這與本研究一致，同時也輔助證明miR-182參與HPVSMC的增殖。

本研究中首次報道了miR-182在PAH患者中高表達，為PAH患者的診斷提供新的幫助。miR-182通過調節(jié)MEF2C促進HPVSMC的增殖，參與PAH的發(fā)生、發(fā)展，為PAH的發(fā)病機制提供新的思路，并且為其治療提供新的靶點。