葉海瓊，傅曉冬，鐘 華

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州 646000)

妊娠期疾病是妊娠期特有的疾病，是孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因之一[1-3]。因此，研究該疾病的發(fā)病機(jī)制和有效治療靶點(diǎn)十分迫切。AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，它表達(dá)于各種代謝相關(guān)的器官中，能被機(jī)體各種刺激激活[4-5]。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)可能與妊娠高血壓的發(fā)病相關(guān)[6-7]，AMPK作為HO-1的上游調(diào)控因子，是否參與了妊娠期高血壓的發(fā)病，目前尚不明確。因此，本研究探討妊娠高血壓發(fā)病過程中AMPK表達(dá)的變化，以及激活A(yù)MPK對(duì)妊娠期高血壓大鼠的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡的雄性和雌性SD大鼠各30只，按雌雄1∶1大鼠合籠，次日清晨用生理鹽水蘸濕小棉簽，取雌鼠陰道分泌物并進(jìn)行涂片，白片置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)精子計(jì)為第0天；妊娠第12天測(cè)量所有孕鼠基礎(chǔ)血壓并收集24 h尿量，于妊娠第14天將妊娠大鼠分為3組，分別為正常妊娠組，一氧化氮(NO)合酶抑制劑亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)組，L-NAME+阿卡地新(AICAR)組，每組10只。

1.2方法

1.2.1模型建立 妊娠第14天開始兩組給予L-NAME 80 mg·kg-1·d-1灌胃，建立大鼠妊娠期高血壓模型，正常妊娠組予等量生理鹽水灌胃對(duì)照。L-NAME處理后2 d(妊娠第16天)再次測(cè)量各組孕鼠血壓，后兩組血壓升高達(dá)大鼠高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)者納入實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)每日灌胃L-NAME 80 mg·kg-1·d-1，共7 d，L-NAME+AICAR組于妊娠第16天開始同時(shí)給予AICAR 10 mg/kg腹腔注射4 d。

a:P<0.05,與正常妊娠組比較；b:P<0.05,與L-NAME組比較

圖1各組孕鼠血壓水平變化

1.2.2血壓測(cè)定 用無創(chuàng)大鼠尾動(dòng)脈血壓檢測(cè)儀(玉研儀器公司)于妊娠第12、16、20天測(cè)量各組孕鼠尾動(dòng)脈血壓(即尾容積法測(cè)量大鼠血壓)：將孕鼠放入固定器內(nèi)，將氣囊套在大鼠尾巴中部，連接好測(cè)量?jī)x，脈搏傳感器，待大鼠安靜且血壓測(cè)量?jī)x上出現(xiàn)穩(wěn)定脈搏波形時(shí)，測(cè)量血壓，每測(cè)量1次后待脈搏波形恢復(fù)平穩(wěn)后進(jìn)行下次測(cè)量，每只大鼠測(cè)量5次，取平均值，凡處理后收縮壓比處理前高20 mm Hg且高于115 mm Hg者確定為高血壓模型。

1.2.324 h尿蛋白測(cè)定 妊娠第12、16、20天收集各組孕鼠24 h尿量，當(dāng)天每個(gè)標(biāo)本各組5 mL于本院生化室自動(dòng)生化分析儀測(cè)24 h尿蛋白。

1.2.4胎盤組織蘇木精-伊紅(HE)染色 孕鼠胎盤取材后經(jīng)4%多聚甲醛浸泡，浸蠟后包埋，切片，脫蠟，水化，蘇木精染色，沖洗，1%鹽酸乙醇分化，流水藍(lán)化，伊紅染色，沖洗，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明，封片。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)AMPK、HO-1定位和表達(dá) 取各組孕鼠胎盤組織常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋，切片，白片置于60 ℃烘箱烤片2 h，使組織片黏附于玻片上，取出自然冷卻，脫蠟，蒸餾水浸洗，抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min。孵育一抗：滴加1∶100稀釋過的兔抗HO-1抗體100 μL，均勻敷于組織上，置于4 ℃冰箱中過夜，同時(shí)以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.6Western blot 取各組胎盤組織100 mg，裂解，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，選取HO-1抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，TTBS洗3次后，孵育二抗，采用化學(xué)發(fā)光法，對(duì)條帶進(jìn)行顯影。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況 L-NAME組和L-NAME+AICAR組大鼠經(jīng)過L-NAME處理后與處理前的血壓進(jìn)行比較，均有顯著升高(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)期間各組孕鼠生活狀態(tài)良好，并未發(fā)生死亡。

2.2各組孕鼠血壓水平 妊娠第12天，各組懷孕大鼠的收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。妊娠第16天，與正常妊娠組比較，L-NAME組、L-NAME+AICAR組孕鼠的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓均有明顯升高(P<0.05)，L-NAME組與L-NAME+AICAR組孕鼠的血壓比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。妊娠第20天，與正常妊娠組比較，L-NAME組及L-NAME+AICAR組孕鼠的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常妊娠組的血壓在妊娠第12、16、20天變化不大，見圖1。

2.324 h尿蛋白情況檢測(cè) 妊娠第12天各組孕鼠24 h尿蛋白水平兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。妊娠第16天開始，L-NAME組和L-NAME+AICAR組孕鼠的尿蛋白水平增加。妊娠第20天，與正常妊娠組比較，L-NAME組24 h尿蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予AICAR后，24 h尿蛋白水平顯著降低，與L-NAME組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組孕鼠24 h尿蛋白水平比較

a:P<0.05,與正常妊娠組比較；b:P<0.05,與L-NAME組比較

2.4各組孕鼠胎盤的形態(tài)變化 各組孕鼠胎盤海綿滋養(yǎng)層無顯著變化。正常妊娠組大鼠母血間隙最寬，L-NAME組母血間隙最薄，給予AICAR處理后，母血間隙寬度介于正常妊娠組和L-NAME組之間，見圖2。

圖2 各組大鼠胎盤組織HE染色

2.5胎盤組織中AMPK和HO-1表達(dá)的細(xì)胞定位 在正常妊娠組，棕色的AMPK陽(yáng)性細(xì)胞大量存在；在L-NAME組，AMPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，給予AICAR后，AMPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有所回升。HO-1陽(yáng)性細(xì)胞和AMPK陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)部位相似，正常妊娠組最高，L-NAME組最低，L-NAME+AICAR組有增強(qiáng)但未達(dá)到正常妊娠組水平，見圖3。

圖3 胎盤組織AMPK、HO-1表達(dá)

2.6胎盤組織中AMPK和HO-1表達(dá)水平 與正常妊娠組比較，L-NAME組AMPK和HO-1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與L-NAME組比較，L-NAME+AICAR組AMPK和HO-1表達(dá)水平有顯著性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

a:P<0.05,與正常妊娠組比較；b:P<0.05,與L-NAME組比較

圖4 AMPK、HO-1在胎盤組織中的表達(dá)水平

3 討 論

妊娠期高血壓是妊娠期特有的疾病。由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療方法也受到限制[8]。NO由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，目前被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)血管張力，擴(kuò)張血管，對(duì)妊娠期心血管系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用[9]。L-NAME是NO的抑制劑，能夠抑制NO合成[10]。因此，本研究中采用L-NAME建立妊娠期高血壓模型，符合血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是妊娠期高血壓發(fā)病的中心環(huán)節(jié)這一理論，也是國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用的妊娠期高血壓模型[11]。

AMPK是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，能被細(xì)胞壓力、運(yùn)動(dòng)、激素及能影響細(xì)胞代謝的物質(zhì)等多種刺激激活。有報(bào)道表明，激活A(yù)MPK對(duì)高血壓有保護(hù)作用[12-13]。HO-1是血紅素分解代謝過程中的限速酶，也是胎盤發(fā)育和血管形成的重要因子，已被證實(shí)是AMPK的下游調(diào)控因子。HO-1是近年來發(fā)現(xiàn)的可能與妊娠期高血壓發(fā)病相關(guān)的重要因子，具有調(diào)節(jié)血管性能、松弛血管平滑肌的作用，對(duì)胎盤結(jié)構(gòu)和胎盤血管發(fā)育具有直接作用[14]。有研究表明，HO-1通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)血壓，可能與妊娠期高血壓的發(fā)病相關(guān)[15-17]，但AMPK作為其上游調(diào)控因子，是否參與了妊娠期高血壓的發(fā)病及是否可以作為治療的靶點(diǎn)尚不明確。

HO-1是誘導(dǎo)型血紅素氧合酶，在正常妊娠胎盤組織中高表達(dá)，主要定位于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞，與絨毛血管的生成和發(fā)育有關(guān)[18-19]。研究表明，HO-1具有松弛平滑肌，調(diào)節(jié)血管性能的作用，對(duì)胎盤結(jié)構(gòu)和胎盤血管發(fā)育具有直接的調(diào)節(jié)作用，維持正常妊娠，影響胎兒生長(zhǎng)發(fā)育[20]。流產(chǎn)大鼠模型實(shí)驗(yàn)表明，HO-1能夠激活T細(xì)胞，提高胎兒耐受，對(duì)自然流產(chǎn)患者具有保護(hù)作用，抑制HO-1表達(dá)后，保護(hù)作用消失[21]。與孕早期相比，在足月胎盤中HO-1表達(dá)顯著升高，提示在胎盤血管形成和重塑方面HO-1可能發(fā)揮了重要作用[22-23]。本研究中，L-NAME組胎盤組織中AMPK、HO-1表達(dá)與正常妊娠組比較有所下降， L-NAME+AICAR組表達(dá)較L-NAME組表達(dá)有明顯上調(diào)，表明AMPK、HO-1可能參與了妊娠期高血壓的發(fā)生、發(fā)展。

有研究報(bào)道，海綿滋養(yǎng)層內(nèi)部有部分滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)富含糖原，命名為糖原細(xì)胞，在成熟胎盤組織中，糖原細(xì)胞溶解釋放糖原和激素，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)空泡變，呈現(xiàn)為簇狀聚集[24]。本研究中，AMPK、HO-1也主要表達(dá)與海綿滋養(yǎng)層的細(xì)胞內(nèi)，因此筆者推測(cè)AMPK和HO-1在此類細(xì)胞中高表達(dá)，可能與其能量代謝活躍有關(guān)，但在正常妊娠和妊娠高血壓中發(fā)揮什么樣的作用，還需要進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，本研究表明AMPK、HO-1的表達(dá)與大鼠妊娠期高血壓具有相關(guān)性，可能與妊娠期高血壓的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。AICAR能增加HO-1的表達(dá)并在一定程度上降低血壓，減少24 h尿蛋白，激活A(yù)MPK是否能成為妊娠期高血壓的潛在治療靶點(diǎn)需進(jìn)一步研究。