袁 園，張 瀟，邵 菊，孫 芳，李 蓉

(西南醫(yī)科大學(xué):1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2.藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州 646000)

下肢缺血疾病是動(dòng)脈狹窄或閉塞引起的下肢潰瘍、壞疽、跛行等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致截肢甚至死亡[1]。隨著對(duì)缺血性疾病研究的深入，細(xì)胞移植成為治療下肢缺血的熱點(diǎn)，其機(jī)制為血管新生。富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)是靜脈血經(jīng)梯度離心獲得的血小板濃縮物，含有豐富的自體生長因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(endothelial cell growth factor,EGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors,FGF)等,它們可促進(jìn)血管生長、修復(fù)細(xì)胞、生成新生組織、促進(jìn)肌肉再生等[2-3]。本研究通過對(duì)小鼠下肢缺血模型缺血下肢的血流灌注、血管密度、VEGF-A、PDGF-BB表達(dá)的觀察，探討PRP對(duì)小鼠下肢缺血后血管形成的影響及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、儀器與試劑 雄性C57BL/6J小鼠12只，6～8周齡，體質(zhì)量20 g左右，購買于重慶騰鑫生物科技有限公司。激光多普勒血流儀，購于英國Moor Instruments Ltd公司；反轉(zhuǎn)錄PCR儀，購于美國Bio-Rad公司；熒光倒置相差顯微鏡，購于美國AMG公司。PCR引物，購于上海Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒，購于天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料，購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

圖1下肢血流的激光多普勒掃描圖

1.2方法

1.2.1小鼠下肢缺血模型的建立 小鼠麻醉后，脫盡腹部毛發(fā)，在顯微鏡下，分開股動(dòng)脈與股深動(dòng)脈，結(jié)扎股深動(dòng)脈下緣與腘動(dòng)脈上緣處的股動(dòng)脈干支，離斷雙結(jié)之間的股動(dòng)脈干支，縫合皮膚后復(fù)溫。

1.2.2PRP的制備 選取健康的小鼠，麻醉后腔靜脈抽取靜脈血，梯度離心獲得PRP。血漿置于離心機(jī)，在4 ℃，100 r/min離心10 min，吸取上層清液及中間層血小板于新EP管中，再置于離心機(jī)中，4 ℃，1 600 r/min離心10 min，吸走上層清液的3/4，輕輕混懸，即得到PRP。合并PRP后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整血小板濃度為6×106個(gè)/μL。

1.2.3動(dòng)物分組 小鼠術(shù)后分為2組，即對(duì)照組(腓腸肌注射生理鹽水50 μL)和PRP組(腓腸肌注射PRP 50 μL)，每組6只。

1.2.4激光多普勒掃描小鼠缺血下肢血流灌注 用激光多普勒血流儀掃描并記錄術(shù)前、術(shù)后0、3、7、11、14 d小鼠雙側(cè)下肢的血流灌注情況。應(yīng)用缺血側(cè)/非缺血側(cè)的血流比值評(píng)價(jià)小鼠下肢血流恢復(fù)情況。

1.2.5病理學(xué)檢測(cè) 小鼠術(shù)后14 d處死，取雙側(cè)腓腸肌，制成病理切片用于蘇木精-伊紅(HE)染色、免疫熒光分析。以HE染色評(píng)價(jià)小鼠缺血后的毛細(xì)血管分布情況；免疫熒光部分：用anti-CD31 靶向標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，用anti-α-SMA 靶向標(biāo)記血管平滑肌細(xì)胞,以評(píng)價(jià)缺血部位血管形成和血管穩(wěn)定性。

1.2.6反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè) 提取肌肉組織中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；用軟件Premier6.0設(shè)計(jì)引物，用于反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。VEGF-A引物：上游5′-GCC AGC ACA TAG AGA GAA TGA GC-3′，下游3′-CAA GGC TCA CAG TGA TTT TCT GG-5′；PDGF-BB引物：上游5′-CAT CCG CTC CTT TGA TGA TCT T-3′，下游3′-ATG AGC TTT CCA ACT CGA CTC C-5′；GAPDH引物:上游5′-TTC ACC ACC ATG GAG AAG G-3′，下游3′-CTC GTG GTT CAC ACC CAT C-5′。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 s，55.3 ℃退火30 s，其中VEGF-A 39個(gè)循環(huán)，PDGF-BB 48個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后，計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平，相對(duì)表達(dá)水平等于2-△Ct，其中-△Ct=基因(Ct)-DAPDH(Ct)。

2 結(jié) 果

2.1激光多普勒?qǐng)D像分析 通過對(duì)小鼠雙下肢的掃描記錄和分析，PRP組的血流恢復(fù)優(yōu)于對(duì)照組，說明PRP能促進(jìn)小鼠缺血下肢的血流恢復(fù)。前3 d兩組血流恢復(fù)無顯著性差異，從第7天開始，PRP組的血流恢復(fù)要優(yōu)于對(duì)照組的血流恢復(fù)，第14天，PRP組雙下肢的血流無顯著性差異，見圖1。

2.2小鼠下肢缺血血流恢復(fù)比值 用缺血側(cè)/非缺血側(cè)的血流比值評(píng)價(jià)下肢缺血側(cè)血流恢復(fù)情況，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PRP組的血流恢復(fù)情況優(yōu)于對(duì)照組的恢復(fù)情況，見圖2。

a:P<0.05，與對(duì)照組比較

圖2下肢缺血血流恢復(fù)比值

2.3病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1HE染色分析 通過對(duì)小鼠缺血側(cè)與非缺血側(cè)的腓腸肌HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)非缺血側(cè)的血管較少，缺血側(cè)形成的血管較多，與對(duì)照組比較PRP組有更多的血管，見圖3。

圖3缺血側(cè)與非缺血側(cè)的HE染色圖(箭頭所指為毛細(xì)血管,×10)

圖4 免疫熒光圖片(綠色為CD31染色；紅色為α-SMA染色)

2.3.2免疫熒光分析 肌肉組織的熒光免疫分析顯示，與對(duì)照組比較，PRP組CD31和α-SMA的陽性表達(dá)更多，其血管密度有明顯差異，見圖4。

a:P<0.05，與對(duì)照組比較

圖5缺血側(cè)與非缺血側(cè)的VEGF-A的反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果圖

2.4反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果

2.4.1VEGF-A的表達(dá)情況 反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果分析顯示，缺血側(cè)兩組的VEGF-A的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PRP組表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05);非缺血側(cè)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

a:P<0.05，與對(duì)照組比較

圖6缺血側(cè)與非缺血側(cè)的PDGF-BB的反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果圖

2.4.2PDGF-BB的表達(dá)情況 反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果分析顯示，缺血側(cè)兩組的PDGF-BB表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PRP組表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)；非缺血側(cè)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

3 討 論

下肢缺血疾病是常見的外周動(dòng)脈疾病之一，嚴(yán)重危害人們健康，常見的治療方法有外科手術(shù)、介入治療、藥物溶栓等，但均達(dá)不到良好的治療效果。血管新生是缺血部位恢復(fù)血流灌注最有效的方法，是治療下肢缺血最徹底的手段，現(xiàn)已成為臨床上的研究重點(diǎn)。

PRP含有多種與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子，如：VEGF、PDGF、TGF-β、EGF等。VEGF能增加血管活性物質(zhì)、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和趨化，直接參與血管新生的整個(gè)過程[4-5]。其中VEGF-A的作用尤為突出，它是促進(jìn)血管新生和生長的主要生物因子，可以促進(jìn)血管新生及側(cè)枝血管的形成[6]。

PDGF-BB由血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞等產(chǎn)生，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增生有重要作用，有利于血管的成熟、穩(wěn)定和存活[7]。PDGF-BB在血管生成中具有招募周細(xì)胞的重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB能提高B16小鼠黑色素瘤模型中周細(xì)胞濃度和腫瘤微血管密度[8]；若抑制了PDGF-BB信號(hào)，腫瘤血管中周細(xì)胞會(huì)大量減少，也可導(dǎo)致腫瘤血管退化[9]。

除此之外，PRP還含有能促增殖、分化、遷移、黏附的細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)，肝細(xì)胞生長因子(HGF)可以協(xié)同VEGF促進(jìn)血管化；IGF和FGF能促進(jìn)組織修復(fù)、成熟和重塑[10]。它們能在不同的階段發(fā)揮出不同的作用，共同作用于受損區(qū)域，刺激血管生成并使其更加成熟、穩(wěn)定。PRP豐富的生物因子為組織重塑、創(chuàng)面愈合和促進(jìn)血管生成等方面提供了獨(dú)特的性能，且制備簡單方便、效果好，在臨床上應(yīng)用廣泛[11]。

綜上所述，PRP能促進(jìn)缺血部位的血管形成和血管的成熟穩(wěn)定，從而促進(jìn)缺血組織的血流恢復(fù)，為臨床上PRP用于外周缺血疾病的治療提供了一定的依據(jù)。