羅俊波 鄭瑞鋒 王彥威 文海英 莊紅麗

乳腺癌是當今危害女性健康的第一大腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首[1]。目前我國乳腺癌發(fā)病率為21.6/10萬，較10年前增長了近一倍[2]。近年來隨著醫(yī)療水平的提高，乳腺癌的總體5年生存率有所提高，但某些分子類型乳腺癌的預后仍不盡如人意，尤其是基底細胞型乳腺癌[3]。乳腺癌的預后取決于其分子類型與TNM分期，尋找可靠、穩(wěn)定且無創(chuàng)的早期篩查指標無疑可為乳腺癌患者的治療贏得時間，對預后具有重要意義。近年來，關于基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在惡性腫瘤中也有重要發(fā)現(xiàn)[4-5]。MMP-2和MMP-9是一類重要的水解細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，參與到腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移過程。Chan等[4]運用免疫組化技術(shù)在939例膀胱癌患者組織中同樣發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，癌組織中MMP-2的表達顯著升高，且MMP-2高表達者預后更差。Shi等[5]發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，子宮內(nèi)膜癌患者血清MMP-9水平顯著增高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。

本研究通過對60例乳腺癌患者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平進行分析，旨在探究三者與乳腺癌臨床病理特征之間的關系及在乳腺癌患者預后評估中的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月至2016年1月期間入我院就診的乳腺癌患者60例，所有患者均經(jīng)病理學確診。乳腺癌分子分型的依據(jù)來自術(shù)中切除的腫瘤組織的免疫組化結(jié)果。乳腺癌的分期參照美國腫瘤聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第8版乳腺癌分期系統(tǒng)[6]，其中Luminal A 型19例、Luminal B型 16例、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor2，HER2)過表達型11例、基底細胞型14例，Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌38例、Ⅲ～Ⅳ乳腺癌22例。同期選取健康體檢者80例。乳腺癌患者納入標準：①意識清楚，語言表達能力正常，能與調(diào)查人員進行正常的溝通；②與研究者進行研究目的溝通后，研究對象自愿參與本研究；排除標準：①已在外院接受放化療或免疫治療者；②急慢性感染、甲狀腺疾病、其他的良惡性腫瘤者；③患者或其家屬不愿意簽署知情同意書者。從患者入院開始對納入的60例乳腺癌患者進行隨訪，隨訪日期截止至2017年9月，隨訪時間為16～40個月。本研究的開展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2 臨床資料采集

由專業(yè)人員收集所有納入對象的臨床資料如：年齡、吸煙史、飲酒史、體重指數(shù)(BMI)等，BMI計算方法為體重/身高2(kg/m2)。

1.3 臨床樣本采集與檢測方法

使用含促凝劑采血管抽取乳腺癌患者治療前及健康體檢者靜脈血10 ml。血清CA15-3的檢測采用化學發(fā)光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供，采用美國貝克曼庫爾特公司UniCel DxI 800分析儀進行檢測。質(zhì)控品采用英國朗道公司腫瘤高、低值質(zhì)控品，質(zhì)控判斷標準為Westgard多規(guī)則分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測每組對象血清MMP-2和MMP-9水平，試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供，檢測過程嚴格按照試劑盒說明進行，簡明步驟如下：所有標本經(jīng)稀釋(1∶100)后依次加入微孔板中與抗體室溫孵育40 min(分別加入MMP-2濃度為200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL的4個標準品、陽性和陰性對照，MMP-9濃度為100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL的4個標準品、陽性和陰性對照)，洗板5次，在避光條件下加入酶標記的單抗室溫孵育40 min，再洗板5次，加入底物反應15 min后終止反應，于Nanodrop ND2000分析儀(美國賽默飛世爾公司)上檢測吸光值(A)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 臨床基本信息

所有研究對象的臨床基本信息，見表1。乳腺癌患者和健康體檢者之間在年齡、吸煙史、飲酒史、糖尿病史和BMI方面的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 研究對象血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平比較

乳腺癌患者和健康體檢者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平，見表2。與健康組相比，乳腺癌患者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平均增高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 60例乳腺癌患者和80例健康體檢者的臨床基本信息

表2 60例乳腺癌患者和80例健康體檢者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平

2.3 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平與乳腺癌臨床病理特征的關系

如表3所示，乳腺癌患者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平與乳腺癌患者年齡、BMI、吸煙與否、飲酒與否等無顯著關系(P>0.05)，而與腫瘤的分子分型(與血清MMP-2、MMP-9和CA15-3的R2分別為0.296、0.285、0.283，P<0.001)、TNM分期(與血清MMP-2、MMP-9和CA15-3的R2分別為0.310、0.276、0.303，P<0.001)顯著相關。血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平在基底樣型乳腺癌患者中的增高最為明顯，其次為HER2陽性型。此外，三者在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者中的水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者(P<0.05)。

2.4 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3對乳腺癌的風險評估

多元Logistic回歸分析結(jié)果，見表4。單因素分析顯示，MMP-2、MMP-9和CA15-3是乳腺癌的危險因素；多因素分析顯示，在校正年齡、吸煙、飲酒、糖尿病等因素影響后，MMP-2、MMP-9和CA15-3高表達是乳腺癌的獨立危險因素。

表3 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平與乳腺癌臨床病理特征間的關系

表4 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3等指標對乳腺癌的預測價值

注：a校正年齡、吸煙、飲酒、糖尿病等因素影響。

2.5 生存分析

60例乳腺癌患者依據(jù)MMP-2、MMP-9和CA15-3水平的中位數(shù)分別被分為高MMP-2與低MMP-2組、高MMP-9與低MMP-9組和高CA15-3與低CA15-3組。同低MMP-2組相比，高MMP-2組患者的生存時間顯著降低(log-rankP=0.026，圖1A)；同低MMP-9組相比，高MMP-9組患者的生存時間顯著降低(log-rankP=0.012，圖1B)而高CA15-3與低CA15-3組間的生存時間差異無統(tǒng)計學意義(log-rankP=0.563，圖1C)。

圖1 生存分析

3 討論

依據(jù)2012年國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，我國乳腺癌總發(fā)病率約為43/10萬，其中城市為52/10萬，農(nóng)村為23/10萬[7-8]。近年來，雖然乳腺癌的死亡率在逐年下降，但其發(fā)病率卻在逐年升高。目前臨床上乳腺癌的診斷主要依賴于乳腺X線攝影、超聲和實驗室腫瘤標記物指標，然而都存在著敏感性低、特異度不高等問題。乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)與診斷，是改善患者預后，提高生存率的有效方法。目前，乳腺X線攝影檢出乳腺癌敏感度為70%～75%，特異度約為65%，而超聲的敏感性和特異性均只有近60%[9]。因此，臨床上迫切需要找尋具有更高敏感性、特異度的生物標記物。

實驗室診斷乳腺癌的指標主要是CA15-3，而其敏感性只有約55%[10]。近年來國內(nèi)外多個研究報道指出血清MMP-2和MMP-9在重塑腫瘤微環(huán)境、促進腫瘤遠處轉(zhuǎn)移、以及在腫瘤診斷及預后等評價中具有積極的價值[11-14]。MMP-2和MMP-9是一類重要的水解細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，參與到腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤相關巨噬細胞可以通過旁分泌途徑釋放MMP-2和MMP-9。Jiang等[11]發(fā)現(xiàn)胃癌細胞中過表達鈣粘蛋白17可以顯著提高癌細胞釋放MMP-2，而MMP-2可通過NF-κB通路促進癌細胞的增殖，并與患者預后不良相關。此外，Xu等[12]運用實時熒光定量聚合酶鏈反應分析發(fā)現(xiàn)，與健康人相比胃癌患者血漿MMP-2基因的表達顯著升高。在子宮內(nèi)膜癌研究中，Zhang[13]發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細胞中MMP-9可降低四氫大麻醇的表達，進而抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Pietruszewska等[14]應用免疫組化技術(shù)在210例頭頸部癌患者組織中同樣發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比癌組織中MMP-2與MMP-9水平顯著增高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P<0.05)。然而，關于血清MMP-2和MMP-9對乳腺癌預后評估的臨床價值相關研究未見報道。因此，本研究我們通過對60例確診為乳腺癌患者外周血MMP-2和MMP-9進行分析并隨訪，同時結(jié)合乳腺癌相關腫瘤標記物CA15-3，旨在探討血清MMP-2、MMP-9和CA15-3在乳腺癌患者預后評估中的價值。

本研究我們發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，乳腺癌患者血清CA15-3、MMP-2和MMP-9水平均顯著增高，且血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平在基底樣型乳腺癌患者中的增高最為明顯，其次為HER2陽性型。此外，三者在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者中的水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者。基底樣型乳腺癌是惡性程度最高的一類，MMP-2、MMP-9和CA15-3水平的顯著提高提示三者在該亞型患者腫瘤發(fā)展中起重要作用。相關性分析顯示血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平與腫瘤的分子分型、TNM分期顯著相關，與前期多個學者在其他腫瘤中的發(fā)現(xiàn)相一致[11，13-14]，提示MMP-2、MMP-9和CA15-3可能參與乳腺癌的進程中。多因素分析顯示，在校正年齡、吸煙、飲酒、糖尿病等因素影響后，高MMP-2、高MMP-9和高CA15-3是乳腺癌的獨立危險因素。最后，我們進行了指標的預后評估，發(fā)現(xiàn)高MMP-2組和高MMP-9組患者的生存時間顯著短于低MMP-2組和低MMP-9組患者，而血清高CA15-3與低CA15-3組間的生存時間差異無統(tǒng)計學意義，提示乳腺癌患者血清MMP-2和MMP-9水平在評估患者預后中具有潛在價值。然而，本次研究仍有如下不足：①本次研究納入的患者均來自于本院，這可能會對研究結(jié)果造成一定的偏倚影響，今后需要多中心的隊列研究來進一步驗證我們的結(jié)果；②本研究納入60例乳腺癌患者，例數(shù)有限，后期需要更大樣本量的研究來證實血清MMP-2、MMP-9和CA15-3對我國乳腺癌患者的臨床價值。

通過本次實驗，我們發(fā)現(xiàn)血清MMP-2和MMP-9在評估乳腺癌患者預后中具有重要的臨床意義，有望為臨床乳腺癌患者的診療及預后改善提供新的途徑與思路。