王海璐 田淞宇 陳秀瑋 王榆平 侯思宇

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤，最常見為子宮內(nèi)膜腺體來源，是女性生殖類三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占女性全身惡性腫瘤的7%，約占女性生殖道腫瘤的20%～30%，居女性生殖道惡性腫瘤的第四位[1]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率呈逐年上升并有年輕化的趨勢[2]。每年增加2.4%，死亡率增加了1.9%，5年和10年的相對存活率分別是82%和79%[3-5]。子宮內(nèi)膜癌的診刮為盲刮，對于較小的病灶容易出現(xiàn)漏診，有文獻(xiàn)報導(dǎo)這種盲刮的漏診率可達(dá)35%[6]，即使有經(jīng)驗的專家刮診時也有10%～25%的宮腔疾病被漏診，尤其是宮底、宮角等特殊部位[7]。子宮內(nèi)膜癌死亡率較高，仍然是1個相對嚴(yán)重的問題，確定子宮內(nèi)膜癌的有效生物學(xué)標(biāo)志，對于內(nèi)膜癌患者提供早期診斷和提供靶向治療，發(fā)現(xiàn)特異性生物學(xué)標(biāo)志，可以有效預(yù)測子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后及發(fā)展，值得我們?nèi)ブ匾暋?/p>

1 材料與方法

1.1 對象和選取組織

選取2011年1月至2012年1月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的80例診斷為EC患者的包埋病理組織樣本，。所有EC患者術(shù)前沒有接受任何放化療。內(nèi)膜癌手術(shù)范圍包括次廣泛全子宮切除+雙附近切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。手術(shù)切除后行病理檢查，判斷組織學(xué)類型，細(xì)胞分級，基層浸潤深度，脈管轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有研究患者手術(shù)病理分期和組織學(xué)分期基于2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(Federation international of gynecology and obstetrics,FIGO)。另取2016年1月至2017年1月婦科手術(shù)切除或刮宮的子宮內(nèi)膜標(biāo)本，正常子宮內(nèi)膜組織10例，臨床資料及病理資料收集完整。

1.2 試劑與方法

Anti-PBXIPI antibody(ab84752),購自Abcam公司。PV-6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組化常規(guī)試劑：PBS緩沖液，氯化鈉，二甲苯，酒精，碳酸氫二鈉過氧化氫，蘇木精，蒸餾水等均由哈醫(yī)大形態(tài)中心提供。

1.3 免疫組織化學(xué)

標(biāo)本采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化染色法來研究HPIP在EC和正常內(nèi)膜組織中的表達(dá)。①切片：對采集的組織蠟塊連續(xù)切片，在溫水中展開，用載玻片撈取組織切片；②脫蠟、水化：置入60 ℃恒溫箱中預(yù)熱20 min，依次浸入二甲苯(10 min 2次)、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min；③洗片：用蒸餾水沖洗5 min，用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；④阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：組織玻璃片浸入3%過氧化氫中15 min，用PBS沖洗3次；⑤抗原修復(fù)：將組織置入抗原修復(fù)盒中，倒入0.01 mol/l枸櫞酸鈉緩沖液(PH6)，在高壓鍋內(nèi)沸水加熱4 min，冷卻至常溫，PBS緩沖沖洗液3次；⑥滴加一抗體：每張切片滴加HPIP多克隆抗體(稀釋比例1∶200)完全覆蓋組織，陰性加蒸餾水，鋪于孵育濕盒在4 ℃的冰箱中過夜，PBS緩沖液洗沖3次，每次3 min；⑦滴加二抗體：用濾紙去除多余的PBS緩沖液，滴加PV山羊抗兔IgG/HRP聚合物，平鋪于濕盒中，室溫孵育30 min，PBS緩沖液3次，每次3 min；⑧DAB染色：新配置的DAB染色劑，滴加在每張玻片上，置于顯微鏡顯色情況，顯微鏡觀察確定反應(yīng)終止時間，蒸餾水沖洗干凈；⑨蘇木精復(fù)染：蘇木精復(fù)染1～2 min，用蒸餾水沖洗干凈，在顯微鏡下染色滿意后，依次75%乙醇(5 min，1次)、85%乙醇(5 min，1次)、95%乙醇(5 min，1次)，100%乙醇(10 min，2次)，脫水干燥，中性樹膠封片，置入80 ℃恒溫烤箱內(nèi)烤干。

1.4 實驗結(jié)果評價標(biāo)準(zhǔn)

全部染色組織切片由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)專家在雙盲法下獨立判斷。染色程度評分：0分(無染色)、1分(弱染色)、2分(中度染色)、3分(強染色)。表達(dá)強度：0分(0%～5%陽性細(xì)胞)、1分(5%～25%陽性細(xì)胞)、2分(26%～50%陽性細(xì)胞)、3分(51%～75%陽性細(xì)胞)、4分(>75%陽性細(xì)胞)。最終評分相乘。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，正常組織HPIP蛋白的表達(dá)和EC中HPIP的表達(dá)存在明顯差異，EC患者的HPIP蛋白表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系應(yīng)用卡方檢驗。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPIP蛋白在正常內(nèi)膜組織和EC組織中表達(dá)情況

免疫組化實驗顯示：HPIP在正常內(nèi)膜組織和EC中的表達(dá)陽性顆粒都分布在胞質(zhì)中，呈棕黃色。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)的分析，正常內(nèi)膜組織中的HPIP陽性表達(dá)率為10%(1/10)。EC組織中HPIP陽性率73.7%(59/80)。兩者的表達(dá)情況具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 HPIP表達(dá)與EC臨床病理特征的關(guān)系

HPIP蛋白在EC組織中的表達(dá)與患者年齡、腫瘤浸潤深度和腫瘤脈管浸潤無顯著關(guān)系(P>0.05)，但是與手術(shù)病理FIGO分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 HPIP在EC中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系/例

3 討論

HPIP蛋白也稱前B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子相互作用蛋白[8]，該蛋白既是1種核質(zhì)穿梭蛋白也是1種微管結(jié)合蛋白[9]，隨著對HPIP細(xì)胞研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)造血前B細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子(PBX)相互作用蛋白(HPIP/PBXIP1)在癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。證據(jù)顯示HPIP與腫瘤關(guān)系極其密切，具有一定的癌基因特性，它在許多人類惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺浸潤性導(dǎo)管癌[10]、肝癌[11]、胃癌[12]、口腔癌[13]、結(jié)直腸癌[14]，并且在腫瘤的發(fā)生、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。與惡性腫瘤相比，HPIP蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織中是否存在差異性表達(dá)，從而確定其與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。研究HPIP蛋白與子宮內(nèi)膜癌的分級、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、及患者的發(fā)病年齡等的相關(guān)性，從而確定其高表達(dá)可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。HPIP可能惡性腫瘤精準(zhǔn)治療的新突破[7]。

影響子宮內(nèi)膜癌患者臨床復(fù)發(fā)及其預(yù)后的危險因素主要有淋巴血管間隙浸潤、子宮腔受累范圍、基層浸潤深度以及組織學(xué)分級[15]。其組織學(xué)分化越低，肌層浸潤越深，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多，其預(yù)后越差。研究表明，高、中、低分化的5年生存率分別為94%、84%、72%[16]。影響EC患者預(yù)后已知因素包括患者年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級及手術(shù)治療效果等。因此有必要對其免疫機制進(jìn)行研究，旨在研究HPIP蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)意義。

本研究表明，HPIP蛋白高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展有密切的關(guān)系。HPIP可以作為EC進(jìn)展及預(yù)后的1個獨立的生物學(xué)標(biāo)志。我們研究HPIP蛋白在EC的表達(dá)與其臨床病理特征的相關(guān)性。我們采用免疫組化實驗方法，觀察EC組織和正常子宮內(nèi)膜組織的HPIP蛋白的表達(dá)情況，實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示HPIP蛋白高表達(dá)與EC臨床分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。這些結(jié)果都表明HPIP蛋白在EC的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，我們所研究的結(jié)果與之前HPIP蛋白在這種癌癥中對于腫瘤發(fā)展的研究結(jié)果一致[2,17-18]。研究發(fā)現(xiàn)HPIP蛋白的表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的生物學(xué)作用。

到目前的研究為止，一些研究可以解釋HPIP蛋白促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，HPIP高表達(dá)導(dǎo)致某些癌基因的活化，例如細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、細(xì)胞周期蛋白D1[14]、而且最近證明HPIP蛋白在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵的作用,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。WANG等研究表明HPIP蛋白在P13K/ART信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用，其調(diào)節(jié)多種生物學(xué)行為，例如細(xì)胞凋亡，腫瘤發(fā)生，細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。一些研究也證明，HPIP蛋白可以在幾種癌細(xì)胞中介導(dǎo)特異性雌激素受體信號的傳導(dǎo)。FENG等推測HPIP蛋白可以激活結(jié)直腸癌細(xì)胞中MAPK/ERK通路，從而促進(jìn)腫瘤的增殖和遷移[12]。這些研究提供了重要的信息，都可以證明HPIP蛋白在促進(jìn)癌癥的發(fā)生和腫瘤的發(fā)展的機制，HPIP高表達(dá)的患者有較差的預(yù)后。

HPIP蛋白抑制鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原9細(xì)胞系(SCC9)的分化和增殖，同時抑制質(zhì)形成細(xì)胞系(NHEK)的碳酸脂質(zhì)的遷移[13]。在體外敲出HPIP蛋白可以抑制癌細(xì)胞的生長在炎癥浸潤細(xì)胞中，HPIP蛋白的表達(dá)呈陽性[20]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌前病變組織中HPIP蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯高于Ki-67表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)量，HPIP蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞所在的區(qū)域被認(rèn)為上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到明顯干擾。HPIP蛋白可能將應(yīng)用于口腔癌抗癌療法的潛在靶標(biāo)[13]。有研究表明，HPIP蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，通過激活MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信號通路來促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換[12]，HPIP蛋白抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，BCL2是HPIP調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。LY294002或PD98059治療結(jié)直腸癌的機制是通過抑制AKT和ERK1/2信號蛋白的磷酸化，從而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12]。

本實驗主要研究HPIP蛋白促進(jìn)EC的發(fā)生、發(fā)展。此研究不足是研究的病例數(shù)量少，因此需要1個大的樣本研究設(shè)計，結(jié)果會更加信服。進(jìn)一步研究HPIP在EC中的作用，并且研究其作用通路及機制，確定HPIP是否結(jié)合其他信號蛋白改善EC患者預(yù)后。