李 芳，茅 丹，代嫚嫚，張慧敏，馬 群，白露雨，何 寧，2，3

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，合肥 2300122安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，合肥 2300123中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012

近年來，黏膜給藥系統(tǒng)發(fā)展迅速。由于黏膜部位具有角質(zhì)化程度低、通透性好、毛細(xì)血管豐富、吸收迅速等優(yōu)點(diǎn)，因此可避免口服藥物的首過效應(yīng)，提高藥物生物利用度[1]。研究顯示，通過鼻腔[2- 3]、口腔[4- 5]、腸[6]等黏膜給藥可以實(shí)現(xiàn)藥物的全身治療。眼部黏膜作為人體重要的黏膜，目前研究主要集中在治療眼局部疾病[7]，主要包括眼部感染、干眼癥、青光眼、視網(wǎng)膜病變等。眼部給藥發(fā)揮局部作用的藥物吸收途徑主要包括角膜滲透和結(jié)膜滲透[8]。角膜是藥物發(fā)揮局部作用的主要吸收途徑，藥物與角膜接觸并滲入角膜，進(jìn)一步進(jìn)入房水經(jīng)前房到達(dá)虹膜和睫狀肌，被局部血管網(wǎng)吸收發(fā)揮局部作用。結(jié)膜內(nèi)有著豐富的血管和淋巴管，藥物經(jīng)結(jié)膜吸收后，經(jīng)鞏膜轉(zhuǎn)運(yùn)至眼球后部，再經(jīng)結(jié)膜血管網(wǎng)進(jìn)入體循環(huán)，這一吸收途徑不利于藥物進(jìn)入房水發(fā)揮局部治療作用。眼部給藥后藥物還極易通過多種途徑代謝消除[9]，主要包括：藥物經(jīng)淚液從眼表面清除；藥液流入鼻淚管和鼻腔后快速吸收進(jìn)入全身循環(huán)清除；經(jīng)多種途徑進(jìn)入前房的藥物會經(jīng)房水循環(huán)入血消除；藥物從房水還可經(jīng)血房水屏障進(jìn)入全身循環(huán)消除；進(jìn)入眼后段的藥物可經(jīng)血視網(wǎng)膜屏障進(jìn)入全身循環(huán)消除，因此，眼部局部給藥的生物利用度一般都很低。基于眼部的特殊解剖生理學(xué)特征，以及眼部給藥后藥物可經(jīng)多種途徑進(jìn)入體循環(huán)代謝清除的事實(shí)，我們認(rèn)為經(jīng)眼部給藥可使藥物直接吸收進(jìn)入體循環(huán)，從而治療全身性疾病。有研究表明，噻嗎心安、匹魯卡品等滴眼液在眼部局部給藥后，血藥濃度均較高，從而極易導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)不良反應(yīng)，這也提示我們藥物經(jīng)眼部可進(jìn)入全身循環(huán)[10- 11]。Chiou[12]研究發(fā)現(xiàn)，胰島素等藥物在吸收促進(jìn)劑的存在下經(jīng)眼部途徑可實(shí)現(xiàn)全身給藥。所以，藥物經(jīng)眼部跨屏障入血有望成為藥物全身給藥的新途徑。

尼莫地平(nimodipine，NMD)是典型的第2代吡啶類鈣拮抗劑，臨床應(yīng)用較多，能選擇性擴(kuò)張腦血管并緩解腦血管痙攣，是美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的血管痙攣的唯一治療藥物，對腦卒中、偏頭痛，急性腦梗死、心絞痛、心肌梗死、老年癡呆及突發(fā)性耳聾也有良好的療效[13]。NMD現(xiàn)已上市的劑型有片劑、膠囊劑和注射劑。由于該藥溶解度差，胃腸道給藥后具有嚴(yán)重的首過效應(yīng)，生物利用度較低[14]；靜脈注射后在體內(nèi)廣泛分布，脾、肺和心臟等器官分布較多，而腦內(nèi)濃度較低[15]。本研究以NMD為模型藥物，比較了藥物經(jīng)眼部給藥、靜脈注射和灌胃給藥后大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)表現(xiàn)，探討了藥物經(jīng)眼部給藥后發(fā)揮全身治療作用的可行性，以期為藥物跨眼部屏障入血的研究提供理論依據(jù)，為具有全身治療作用的眼用制劑的研究提供參考。

材料和方法

試劑和儀器NMD原料藥(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，純度>98.0%)；NMD標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號100270- 201403，純度99.7%)；尼群地平(nitrendipine，NTD)標(biāo)準(zhǔn)品(南京森貝伽生物科技有限公司，批號170826，純度>98.0%)；NMD眼膏劑[自制，基質(zhì)為黃凡士林∶羊毛脂∶液狀石臘(8∶1∶1)的混合物，每克基質(zhì)中含NMD 12.0 mg]；NMD口服溶液(自制，以50%的PEG 400作為溶劑，每毫升中含尼莫地平5.0 mg)；NMD注射液(自制，以乙醇∶PEG 400∶水=25∶45∶30的混合溶劑作為溶劑，每毫升中含NMD 5.0 mg)；甲醇和乙腈(美國Sigma公司，色譜純)；水為去離子純水，由Millipore純凈水發(fā)生器制得。LC- 20A 型高效液相色譜儀(日本島津公司)，F(xiàn)A21021B十萬分之一電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)，TG16A-WS臺式高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，渦漩混合器(合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司)，KQ- 50DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

實(shí)驗(yàn)動物健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，試驗(yàn)動物中心提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011- 001]。置于室溫18～25 ℃，相對濕度40%～70%的條件下喂養(yǎng)。

色譜條件色譜柱：Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相∶乙腈-水(60∶40，V/V)；檢測波長：236 nm；柱溫40 ℃；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量：60 μl。

對照溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取 NMD 對照品 10.0 mg，置 100 ml 的容量瓶中用甲醇稀釋至刻度(100 μg/ml)作為貯備液，置4 ℃?zhèn)溆茫ぷ饕涸谑褂们坝少A備液逐級稀釋制得。精密稱取NTD對照品5.0 mg，置 25 ml 的容量瓶中用甲醇稀釋至刻度(200 μg/ml)，隨后將上述溶液用甲醇繼續(xù)稀釋成含NTD 10 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)溶液。

血漿樣品預(yù)處理精密吸取在室溫下自然解凍的血漿樣品100 μl，精密加入NTD(內(nèi)標(biāo))溶液(10 μg/ml)10 μl，渦旋混合1 min，繼續(xù)加入沉淀劑甲醇300 μl，渦旋振蕩3 min，12 000 r/min離心10 min，進(jìn)樣分析。

專屬性取大鼠空白血漿、NMD溶液、空白血漿外加一定濃度NMD和內(nèi)標(biāo)配制的模擬血漿樣品、血漿樣品，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取空白血漿90 μl，加入10 μl不同濃度的NMD對照品，使其濃度分別為0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/ml，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分析，記錄樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積，以 NMD 的峰面積(As)與內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)比值(Y)對血漿中 NMD 的質(zhì)量濃度(C)作線性回歸。

精密度和準(zhǔn)確度在適量空白血漿中加入 NMD的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配成高(10.0 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、低(0.2 μg/ml)濃度的供試溶液各3份。按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)處理后，進(jìn)樣分析，計(jì)算藥物峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線求算實(shí)測濃度，與理論加入濃度比較，計(jì)算方法的準(zhǔn)確度；每個(gè)濃度樣品日內(nèi)測定5份，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間精密度。

提取回收率在適量空白血漿中加入 NMD的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配成高(10.0 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、低(0.2 μg/ml)濃度的供試溶液各5份，各濃度供試液均按“血漿樣品預(yù)處理”及“色譜條件”項(xiàng)進(jìn)行測定，記錄峰面積A1。另取相同濃度的 NMD 標(biāo)準(zhǔn)溶液，不經(jīng)提取處理直接進(jìn)行 HPLC 分析，記錄峰面積A2，由兩者的比值A(chǔ)1/A2計(jì)算提取回收率。

血漿樣品穩(wěn)定性將高(10.0 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、低(0.2 μg/ml)3個(gè)濃度的NMD血漿樣品經(jīng)處理后放置在進(jìn)樣盤中(10 ℃)24 h，檢查其放置穩(wěn)定性；20 ℃ 室溫放置 4 h，檢測其室溫穩(wěn)定性；-86 ℃冰箱中反復(fù)凍融 3 次，檢測其反復(fù)凍融穩(wěn)定性。所有樣品均按照“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法處理，HPLC 測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度。

體內(nèi)藥物動力學(xué)實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)數(shù)字表法將135只SD大鼠隨機(jī)分為靜脈注射(intravenous administration，iv)組(n=45)，眼部給藥(intraocular administration，io)組(n=45)和口服灌胃(intragastric administration，ig)組(n=45)3組。io和iv給藥劑量為5.0 mg/kg，ig組給藥劑量為 10.0 mg/kg。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。io組：將NMD眼用制劑滴入大鼠左、右眼的結(jié)膜內(nèi)，于給藥后 2、5、10、15、30、60、120、180、240 min 分別從大鼠股動脈取血樣適量于含有肝素的離心管中，3000 r/min 離心 10 min 得血漿，血漿樣品于-86 ℃冷凍保存，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，并采用藥動學(xué)軟件DAS 3.2計(jì)算相關(guān)藥物動力學(xué)參數(shù)。iv組：將自制的 NMD 注射液注入大鼠左側(cè)股靜脈，取血時(shí)間及處理方法同上。ig組：將NMD口服溶液劑灌胃給藥，取血時(shí)間及處理方法同上。

結(jié) 果

專屬性空白血漿、NMD對照品、空白血漿加對照品及大鼠給藥后血漿樣品的HPLC 色譜圖見圖1。在以上色譜條件下，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不影響NMD與內(nèi)標(biāo)的分離測定，NMD和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為7.9和9.1 min，其中NMD和內(nèi)標(biāo)NTD的峰形對稱，分離度良好，該方法具有較高的專屬性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線以 NMD的峰面積(As)與內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)比值(Y)對血漿中 NMD的質(zhì)量濃度(C)作線性回歸，如圖2所示，得回歸方程為Y=0.63C+0.02(r=0.9999)，表明血漿藥物濃度在 0.05～10.00 μg/ml 內(nèi)呈良好線性關(guān)系。本方法測得最低檢測限為 0.02 μg/ml (S/N>3)，最低定量限為0.05 μg/ml (S/N>10)，其中，定量限的準(zhǔn)確度為105.4%，精密度RSD為4.78%，表明精密度和準(zhǔn)確度良好。

精密度和準(zhǔn)確度低(0.2 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、高(10.0 μg/ml) 3 個(gè)濃度血漿樣品的日內(nèi)精密度均小于5.67%，日間精密度均小于10.52%，表明儀器精密度良好；準(zhǔn)確度在85%～115%之間，符合生物樣品分析測定的要求(表1)。

NMD：尼莫地平；NTD：尼群地平；HPLC：高效液相色譜法

NMD：nimodipine；NTD：nitrendipine；HPLC：high-performance liquid chromatography

A.空白血漿；B.NMD溶液；C.空白血漿+對照品；D.血漿樣品

A.blank plasma；B.nimodipine solution；C.blank plasma + control；D.plasma sample

圖1HPLC色譜圖

Fig1HPLC chromatogram

圖2NMD在大鼠血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig2Standard curve of NMD in rats’plasma

提取回收率低(0.2 μg/ml)、中(2.0 μg/ml)、高(10.0 μg/ml)3個(gè)濃度的提取回收率分別為92.59%、100.42%、97.54%，均大于80%，表明該提取方法符合生物樣品分析的要求(表2)。

血漿樣品穩(wěn)定性血漿樣品在儲存、反復(fù)凍融后及測定過程中的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)均小于12%，表明NMD血漿樣品在上述條件下具有良好的穩(wěn)定性。

藥物動力學(xué)實(shí)驗(yàn)各組大鼠給藥后其平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3，利用藥動學(xué)軟件DAS 3.2，分別對測得的3種給藥途徑的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，采用非房室模型計(jì)算主要藥物動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示，經(jīng)眼部給藥、灌胃給藥的Cmax分別為0.52、0.20 μg/ml，tmax均為5.0 min；經(jīng)眼部給藥、灌胃給藥、靜脈給藥的AUC0-t分別為21.10、52.58、5.98 μg/(ml·min)。灌胃給藥的絕對生物利用度僅有 5.69% (按相同的給藥劑量即 5 mg/kg 計(jì)算)，眼部給藥的絕對生物利用度達(dá)到 40.13%。

表1 精密度和準(zhǔn)確度測定結(jié)果(%)Table 1 Precision and accuracy of the method(%)

表2 大鼠血漿中尼莫地平的提取回收率 (n=5)Table 2 The extraction and recovery of nimodipine in rats’plasma (n=5)

A1：血漿樣品峰面積；A2：標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；RSD：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

A1：peak area of plasma sample；A2：peak area of standard solution；RSD：relative standard deviation

討 論

目前，檢測生物樣品中NMD的方法有很多，包括HPLC、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)等。本實(shí)驗(yàn)中建立的用于測定大鼠血漿中NMD含量的HPLC法具有精密度和準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)以及簡單易操作等優(yōu)點(diǎn)。NMD與內(nèi)標(biāo)的萃取回收率符合生物樣品分析方法的要求，與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)峰均能得到良好的分離，峰形較好。因此建立的含量測定方法可用于NMD在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究。

本實(shí)驗(yàn)主要利用眼部給藥后大部分藥物可經(jīng)結(jié)膜血管網(wǎng)、房水循環(huán)、血房水屏障、血視網(wǎng)膜屏障等途徑進(jìn)入全身循環(huán)而代謝消除的事實(shí)，探索NMD經(jīng)眼部給藥治療全身疾病的可行性，將治療局部疾病的劣勢轉(zhuǎn)化為治療全身疾病的優(yōu)勢。眼部給藥與注射給藥途徑相比，具有使用方便，患者順應(yīng)性好的優(yōu)點(diǎn)；與口服給藥途徑相比，可避開首過效應(yīng)，提高藥物的生物利用度。

一些心腦血管疾病患者發(fā)病時(shí)大多伴隨惡心、嘔吐等癥狀，胃腸道功能較為低下，導(dǎo)致藥物吸收程度降低。一般而言，藥物的眼部黏膜吸收并不依賴于胃腸道的生理狀態(tài)，故經(jīng)眼部給藥后仍可能有較高的生物利用度。本研究中，在眼部給藥劑量僅為灌胃給藥一半的情況下，NMD經(jīng)眼部給藥后，藥物在大鼠血漿中的Cmax明顯高于灌胃給藥，且灌胃給藥后NMD的絕對生物利用度僅有 5.69%，而眼用給藥制劑的絕對生物利用度高達(dá) 40.13%，是灌胃給藥的 7.06 倍，由此可見經(jīng)眼部給藥相比灌胃途徑有著更高的生物利用度。由于NMD按照正常劑量口服給藥后的生物利用度極低，使得給藥后的血藥濃度非常低，幾乎接近或低于實(shí)驗(yàn)中采用的HPLC法的檢測限，使得濃度測定困難。因此在給藥方案設(shè)計(jì)中，大鼠灌胃給藥劑量為 10.0 mg/kg，是眼部給藥的2倍?？紤]到肝藥酶可能會被飽和而使首過作用不明顯，體內(nèi)過程與實(shí)際情況相差較大，因此實(shí)驗(yàn)中未進(jìn)一步增大灌胃給藥劑量。

綜上，NMD經(jīng)眼部給藥后可以提高生物利用度，能作為口服給藥的替代途徑，且預(yù)示其在臨床上可能得到比口服更好的療效，在治療心腦血管疾病中有著廣泛的臨床應(yīng)用前景。眼部給藥是一種待開發(fā)的、有前途的給藥途徑，研究藥物跨眼部屏障進(jìn)入體循環(huán)，發(fā)揮全身治療作用，具有較高的理論意義和實(shí)用價(jià)值，尤其對于急性疾病的治療，以及一些用藥劑量小、活性高的藥物，其臨床優(yōu)勢更加明顯。研究顯示，促滲劑的應(yīng)用能夠增加藥物跨膜吸收來提高眼用制劑的生物利用度[16]，如冰片能改變血腦屏障、眼角膜、鼻腔黏膜及其他黏膜的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其他藥物透過這些結(jié)構(gòu)到達(dá)作用部位。劉煜德等[17]探討了冰片對川芎嗪經(jīng)鼻腔吸收入腦的影響，結(jié)果表明與川芎噴霧劑組比較，芎冰噴霧劑組川芎嗪更迅速進(jìn)入腦組織并達(dá)到峰濃度，其峰值也高于前者，冰片提高了川芎嗪經(jīng)鼻腔吸收入腦的速度，增加了腦組織中川芎嗪的吸收量。因此，我們將進(jìn)一步探索促進(jìn)劑對NMD經(jīng)眼部給藥后的體內(nèi)過程的影響。