林啟鵬，朱 茜，馬立偉

運(yùn)動神經(jīng)元病是指一類能快速進(jìn)展的致死性神經(jīng)變性疾病，能引起大腦皮質(zhì)、腦干及脊髓運(yùn)動神經(jīng)元變性[1-3]。肌萎縮側(cè)索硬化是最常見的運(yùn)動神經(jīng)元病，能引起患者肌萎縮、肌無力、構(gòu)音障礙和呼吸衰竭，通常不伴有感覺受累。大部分肌萎縮側(cè)索硬化患者在確診后2～5年死亡，在美國和歐洲肌萎縮側(cè)索硬化的發(fā)病率分別是5/10萬和2/10萬；其中約10%為家族性肌萎縮側(cè)索硬化，其余均為散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，利魯唑及依達(dá)拉奉能延緩肌萎縮側(cè)索硬化病進(jìn)展，已被美國FDA批準(zhǔn)用于治療該病。目前尚無其他治愈方法[1-3]。

SOD1基因突變是首個被證實(shí)與肌萎縮側(cè)索硬化疾病發(fā)生相關(guān)的基因突變位點(diǎn)[4]。隨著對肌萎縮側(cè)索硬化疾病的認(rèn)識，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)與肌萎縮側(cè)索硬化相關(guān)，包括SOD1、C9orf72、CHMP2B、FUS及TDP-43等[4,5]。C9orf72 和 CHMP2B突變已被證實(shí)與額顳葉癡呆及肌萎縮側(cè)索硬化相關(guān)[6,7]；Cox等[7]發(fā)現(xiàn)CHMP2B突變的肌萎縮側(cè)索硬化主要表現(xiàn)為下運(yùn)動神經(jīng)元綜合征；而C9orf72突變的肌萎縮側(cè)索硬化表現(xiàn)為上下運(yùn)動神經(jīng)元均受累[4-6]。本研究通過比較C9orf72 和 CHMP2B突變肌萎縮側(cè)索硬化的表達(dá)譜差異來尋找用于診斷及治療肌萎縮側(cè)索硬化的靶點(diǎn)。

1 材料及方法

1.1 差異基因的分析 在GEO數(shù)據(jù)庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)使用“amyotrophic lateral sclerosis”進(jìn)行檢索，獲取2個數(shù)據(jù)集(GSE68605 and GSE19332)，并從中挑選C9orf72突變及CHMP2B突變的樣本。從昂飛公司官網(wǎng)下載基因注釋文件，使用R軟件(3.5.0版本)對樣本進(jìn)行分析[8,9]。

1.2 功能富集分析 對獲得的差異基因采用在線工具DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行功能富集分析，獲取GO分析及KEGG通路分析結(jié)果[10]。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵蛋白的篩選 使用在線功能STRING(http://string-db.org/)及Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行分析及可視化蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[10]；使用Cytoscape 3.6.1軟件中的插件cytoHubba進(jìn)行關(guān)鍵蛋白的篩選[10,11]。

2 結(jié) 果

2.1 納入樣本信息 從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得2個數(shù)據(jù)集(GSE68605 and GSE19332)，從中我們獲得了11個獨(dú)立樣本，其中包含8個C9orf72突變型肌萎縮側(cè)索硬化和3個CHMP2B突變肌萎縮側(cè)索硬化。該樣本的組織均來源于死后患者頸段脊髓的運(yùn)動神經(jīng)元。

2.2 差異基因分析 經(jīng)過分析，共發(fā)現(xiàn)13個差異基因，其中在C9orf72突變型肌萎縮側(cè)索硬化中表達(dá)水平上升的有CALM2、CALM1、CALM3、MT1X、RP11-480A16.1和RYR2；表達(dá)水平下降的有SLIT2、SEZ6L、SEC22B、WTAP、SAMD12、MALAT1和RAP1GDS1(圖1)。

圖1 兩種肌萎縮側(cè)索硬化差異基因的熱點(diǎn)分析

2.3 差異基因功能分析 獲得的13種差異基因經(jīng)DAVID分析后發(fā)現(xiàn)僅有CALM2、CALM1、CALM3 和 RYR2能夠被分類。而這些基因主要參與鈣離子檢測、通過調(diào)控靜息態(tài)鈣離子來調(diào)節(jié)心肌的收縮、調(diào)節(jié)心率、正向調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸代謝過程及鈣調(diào)通路等生物學(xué)過程。同時參與了晝夜調(diào)節(jié)、心肌細(xì)胞中的腎上腺素通路、光傳導(dǎo)、催產(chǎn)素信號通路及鈣信號通路等生物學(xué)通路。GO分析及KEGG分析的前10結(jié)果，見表1、2。

表1 兩種肌萎縮側(cè)索硬化差異基因的功能富集分析(GO分析)

表2 兩種肌萎縮側(cè)索硬化差異基因所涉及的生物學(xué)通路(KEGG分析)

使用STING及Cytoscape軟件分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并使用cytoHubba中的不同算法計算前10關(guān)鍵蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 MCC、Betweenness、BottleNeck、Closeness、Degree和EPC算法中，CALM1、CALM2和CALM3均位于前10的關(guān)鍵蛋白。圖2展示了不同算法中的前10關(guān)鍵蛋白。

圖2 兩種肌萎縮側(cè)索硬化cytoHubba算法計算出的前10關(guān)鍵蛋白

3 討 論

本研究通過生物信息學(xué)分析C9orf72突變肌萎縮側(cè)索硬化及CHMP2B突變肌萎縮側(cè)索硬化的表達(dá)譜差異，從而尋找用于診斷及治療肌萎縮側(cè)索硬化的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。分析后發(fā)現(xiàn)在C9orf72突變肌萎縮側(cè)索硬化樣本中有6個表達(dá)水平升高的基因及7個表達(dá)水平下降的基因。對其功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)主要影響鈣離子通路，并且CALM3、CALM2和CALM1是引起兩種疾病差異的關(guān)鍵蛋白。

CALM1、CALM2和CALM3基因能編碼鈣調(diào)蛋白；鈣調(diào)蛋白又被稱為delta磷酸化酶激酶,它在多種生物學(xué)過程中起著重要的作用，如神經(jīng)生長、代謝、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動、短期和長期記憶、以及免疫反應(yīng)等[12,13]。鈣調(diào)蛋白在腦及心臟中大量存在，而且在多種心臟及癌癥疾病中均發(fā)現(xiàn)CALM基因的突變[12,13]。在心臟疾病合并有兒茶酚胺型多形性室性心動過速、長QT綜合征或特發(fā)性心室顫動的患者常發(fā)現(xiàn)有CALM基因突變[13]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣調(diào)蛋白與突觸可塑性及細(xì)胞骨架重塑有關(guān)[12,14-17]。在以往報道中發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，散發(fā)型肌萎縮側(cè)索硬化患者的鈣調(diào)蛋白表達(dá)水平下降，但在這些散發(fā)的患者中著重排除了SOD1、TARDBP、FUS、VCP、OPTN、UBQLN2或者C9orf72突變的患者[14]。我們發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)蛋白在C9orf72突變肌萎縮側(cè)索硬化患者中表達(dá)水平升高，其原因可能與肌萎縮側(cè)索硬化患者上運(yùn)動神經(jīng)元受損相關(guān)。

本研究采用生物信息學(xué)方法分析兩種類型肌萎縮側(cè)索硬化的表達(dá)譜差異，獲得可能的發(fā)病機(jī)制及治療的靶點(diǎn)。但納入樣本數(shù)少，未經(jīng)過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，可能會對結(jié)果造成影響，希望將來有更多的數(shù)據(jù)可用于分析。

總之，在C9orf72突變肌萎縮側(cè)索硬化患者中，CALM基因表達(dá)水平上調(diào)，這一關(guān)鍵蛋白可能是肌萎縮側(cè)索硬化發(fā)病的重要機(jī)制，也可能是治療該類疾病的重要靶點(diǎn)。