王?，|，柴麗麗，楊國青，陳燕

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一,近年來,越來越多的流行病學(xué)資料顯示,高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染與子宮頸癌及癌前病變的發(fā)生密切相關(guān),而我國是世界上HPV感染率較高的國家之一，因此高危型HPV的檢測對于宮頸癌及癌前病變的篩查顯得尤為重要。此外,在日常診斷工作中,宮頸上皮鱗狀上皮化生,尤其是不成熟鱗化與宮頸上皮病變的鑒別,是困擾病理醫(yī)師的一個難題。研究表明,持續(xù)性感染HPV會導(dǎo)致P16的過度表達(dá)。本研究通過免疫組化法檢測P16蛋白在高危型HPV感染者中的表達(dá),以探討它們在宮頸癌篩查和診斷中的價值及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料對西安市中心醫(yī)院婦科門診2016年1月至2016年12月期間薄層液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)(liquid-based ThinPrep cytology test,TCT)和第二代雜交捕獲法(HC2)二聯(lián)檢測中發(fā)現(xiàn)高危型HPV陽性的226例病人行常規(guī)子宮頸活檢,并聯(lián)合免疫組化檢測P16蛋白的表達(dá)。病人病理切片及免疫組化均由兩位高年資病理診斷醫(yī)師共同給出最終診斷結(jié)果。本研究得到了西安市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，病人或其近親屬簽署了知情同意書。

1.2宮頸細(xì)胞學(xué)檢查采用TCT進(jìn)行檢測,診斷標(biāo)準(zhǔn)采用TBS(the Bethesda system)分類法。分為無宮頸上皮內(nèi)病變(negative for intraepithelial lesion or malignancy,NILM),未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cell,ASU),低度鱗狀上皮細(xì)胞病變(low squamous intraepithelial lesion,LSIL),高度鱗狀上皮病變(high squamous intraepithelial lesion,HSIL)。

1.3高危型HPV檢測所有標(biāo)本均由婦科醫(yī)師用專用細(xì)胞采集器采取，HC2法定量檢測13種HPV-DNA含量(包括HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型)。陰陽性對照標(biāo)本均由試劑盒提供。HPV DNA高危型檢測試劑盒及HC2基因雜交捕獲儀均購自美國Digene公司。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：HPV-DNA≥1.0 pg/mL為陽性；HPV-DNA<1.0 pg/mL為陰性。

1.4免疫組織化學(xué)方法采用MaxVision法檢測P16蛋白。所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,4 μm切片備用,染色步驟按照試劑盒說明書操作。抗體及試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

P16表達(dá)定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì),鱗狀上皮無表達(dá)時記錄為(-),僅基底層和副基底層可見散在少量細(xì)胞P16陽性時記錄為(+),10%～90%的上皮細(xì)胞表達(dá)時為(++),≥90%的上皮細(xì)胞彌漫表達(dá)時記錄為(+++)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析,采用非參數(shù)的Kruskal Wallis秩和檢驗，兩兩比較采用Bonferroni校正，P<0.001為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1宮頸細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果NILM72例,ASU32例,LSIL77例,HSIL45例。

2.2宮頸活檢結(jié)果病理活檢為炎癥/萎縮者73例,低級別上皮病變者98例,高級別上皮病變者55例。宮頸活檢結(jié)果與TCT結(jié)果比較見表1。

表1 宮頸活檢結(jié)果與TCT結(jié)果比較/例

從表1中可以看出,TCT結(jié)果為NILM者中,病理活檢陽性有7例,漏診率約為9.7%(7/72)。

2.3P16蛋白表達(dá)情況P16蛋白在宮頸活檢中的表達(dá)見表2。在炎癥/萎縮病變中,P16多無表達(dá)(圖1)；低級別病變中,大多數(shù)病例P16為局灶陽性,且陽性細(xì)胞占據(jù)鱗狀上皮的下1/3(圖2)；而高級別病變中,P16則為彌漫陽性(圖3)。

圖1 P16蛋白在萎縮中無表達(dá)(HE×100)

圖2 P16蛋白在低級別病變中的表達(dá)(HE×100)

圖3 P16蛋白在高級別病變中的表達(dá)(HE×100)

表2 P16蛋白在宮頸活檢中的表達(dá)

Kruskal Wallis秩和檢驗結(jié)果顯示,P16蛋白表達(dá)在炎癥/萎縮組、低級別病變組及高級別病變組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=158.29，P<0.001)；三組病變間的兩兩比較，采用Bonferroni校正后，P16蛋白表達(dá)均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,幾乎所有子宮頸癌組織中均能檢測到HPV DNA[1],從而驗證了HPV是子宮頸癌的重要病因,尤其是高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件[2]。目前已被鑒定出的HPV類型已超過100種,依其致病性不同可將其分為高危型和低危型兩大類,一般認(rèn)為,高危型HPV如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等,與宮頸癌及宮頸上皮病變的發(fā)生密切相關(guān)；低危型HPV如HPV6、11、42、43等,則常引起生殖道濕疣等良性病變。女性生殖系統(tǒng)HPV感染很常見,但大部分婦女在感染后8～10個月可以自行消除,約5%～10%的持續(xù)感染者才成為子宮頸癌的高危人群。自20世紀(jì)50年代以來,發(fā)達(dá)國家已廣泛開展宮頸癌涂片篩查,其流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,宮頸浸潤癌的發(fā)病率和死亡率已明顯下降[3]；我國宮頸癌的普查率較低,尚未形成成熟的篩查模式[4],因此盡早發(fā)現(xiàn)高危型HPV感染,積極治療宮頸癌前病變,是我國當(dāng)前預(yù)防宮頸癌的重點。

宮頸細(xì)胞學(xué)檢查和高危型HPV檢測是臨床宮頸病變篩查的常規(guī)手段,由于細(xì)胞學(xué)診斷受診斷醫(yī)師主觀因素影響較大,使得其重復(fù)性稍差。有研究認(rèn)為在 HR-HPV 陽性、 TCT 陰性者中高級別上皮病變的檢出率明顯高于 HR-HPV陰性、 TCT 陽性者[5-6]。目前檢測HPV的方法主要有：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、雜交捕獲技術(shù)(Hybrid Capture)、基因芯片導(dǎo)流雜交技術(shù)等。雜交捕獲技術(shù)已經(jīng)被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn),用于30歲以上女性宮頸癌的初篩。將高危型HPV檢測作為常規(guī)篩查手段,可以比通常采用的宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢測更有效地濃縮高風(fēng)險人群,降低漏診率[7]。本研究結(jié)果顯示,226例高危型HPV感染者中,TCT結(jié)果未發(fā)現(xiàn)宮頸上皮病變者為72例,而其中病理活檢陽性者有7例,漏診率約為9.7%(7/72),與上述研究結(jié)論一致。因此HPV(+)者,尤其HPV和TCT均(+)者,應(yīng)及時行宮頸活檢。

P16基因定位于人染色體9p21,編碼P16蛋白，負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。研究表明,P16基因的異常甲基化參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。宮頸組織中P16的強(qiáng)陽性表達(dá)往往提示HPV在宿主細(xì)胞中的整合[9]。大部分學(xué)者的研究報告顯示，P16散在點狀弱陽性常常預(yù)示低危型HPV感染的低級別CIN,而P16彌漫性或帶狀強(qiáng)陽性表達(dá)則預(yù)示高危型HPV感染的高級別CIN[10-11]。因此P16可以作為一種輔助標(biāo)志物，聯(lián)合HR-HPV檢測,有效分流薄層液基細(xì)胞中的ASUS病人[12-14]。本研究結(jié)果顯示，P16的陽性率在炎癥/萎縮組、低級別病變組及高級別病變組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其表達(dá)程度隨病變級別的進(jìn)展而升高,說明P16與宮頸病變的級別密切相關(guān),與陸曉青等[15]的研究結(jié)果一致。此外，在高級別及低級別病變組，P16的表達(dá)明顯高于宮頸炎癥/萎縮組，且表達(dá)類型以彌漫陽性或帶狀陽性為主,不同于炎癥/萎縮組的點灶表達(dá)或無表達(dá)，故P16表達(dá)也有助于宮頸上皮病變與炎癥/萎縮的鑒別。

隨著宮頸癌篩查的普及，HC2法檢測高危型HPV可作為臨床宮頸病變篩查的常規(guī)手段，HR-HPV陽性者應(yīng)及時行陰道鏡下活組織檢查,必要時聯(lián)合應(yīng)用免疫組化行P16蛋白檢測，以提高診斷的準(zhǔn)確率,早期發(fā)現(xiàn)癌前病變、早期干預(yù)。